[发明专利]一种诱导性多能干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法构建了含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，并使用这两种慢病毒感染人外周血单核细胞来获得诱导性多能干细胞(iPSCs)，具体包括下列步骤：(1)人外周血单核细胞的分离与培养；(2)质粒的构建和扩增；(3)慢病毒的构建；(4)慢病毒感染人外周血单核细胞以及iPSCs的获得。本发明将小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc四种转录因子整合到一个质粒上，进而构建了同时含有这四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，利用这两种病毒可使得人外周血单核细胞成为iPSCs。与使用多个含有单个基因病毒的常规iPSCs制备方法相比，本方法减少了所需要病毒的数量，大大简化了慢病毒的制备步骤，并降低了污染的风险。

主权项

1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，具体包括下列步骤：(1)人外周血单核细胞的分离与培养利用Ficoll淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，使用含有生长因子的外周血单核细胞培养液培养4-7天；(2)质粒的构建和扩增构建Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号四种质粒，将所构建好的质粒分别取上清液做转化，用5-alpha大肠杆菌感受态或NEB感受态或C2987H感受态进行转化，均使用氨苄青霉素抗性的固体培养基；次日挑取克隆置于氨苄青霉素的液体培养基中扩增，用质粒提取试剂盒提取质粒；所述Ⅰ号质粒为psPAX2s质粒，此质粒是第二代慢病毒包装质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；所述Ⅱ号质粒为pMD2.G质粒，此质粒是水泡性口炎病毒包膜质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；所述Ⅲ号质粒为TetO-FUW-OSKM质粒，此质粒是在TetO-FUW质粒中插入了Oct4、Sox2、Klf4与c-Myc(OSKM)四种小鼠基因，是一种能被反向四环素反式激活因子诱导表达小鼠Oct4、Sox2、Klf4与c-Myc蛋白的病毒质粒，此质粒在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；所述Ⅳ号质粒为FUW-M2rtTA质粒，此质粒是在FUW质粒上插入反向四环素反式激活因子的基因形成的病毒质粒，此质粒在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；(3)慢病毒的构建使用HEK-293T细胞构建A、B两种病毒，每种病毒由三种质粒构成，分别是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号质粒和Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ号质粒；(4)慢病毒感染人外周血单核细胞以及诱导性多能干细胞(iPSCs)的获得取培养4-7天的人外周血单核细胞，加入A、B两种病毒，之后采用离心法进行病毒感染；第二天将细胞转移至iMatrix-511(购自nippi公司)包被的培养板上，使用含有Doxycycline(购自STEMCELL公司)及生长因子的外周血单核细胞培养液进行培养，每天采用新鲜培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液；第七天使用iPSCs培养液(mTeSRTM1Complete Kit，购自STEMCELL公司)对培养体系进行1/2体积的半量换液，之后每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，直到形成直径1cm的克隆，即获得iPSCs；将克隆转移到新的iMatrix-511包被的培养板上，每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，每4-7天进行iPSCs的传代培养。