[发明专利]一种食品中李斯特菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种食品中李斯特菌的检测方法，采用LAMP扩增方法，以李斯特菌prfA基因特异序列为靶序列，LAMP Visible Dye为可见光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤（1）预处理；（2）构建LAMP扩增反应体系；（3）扩增反应；（4）检测分析。本发明具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中李斯特菌进行快速定性检测，可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。

主权项

一种食品中李斯特菌的检测方法，其特征在于，采用LAMP扩增方法，以李斯特菌prfA基因特异序列为靶序列，LAMP Visible Dye为可见光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到LB肉汤中，培养温度为32‑38℃，培养时间为18‑20h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后进行提取总RNA，加入液氮研磨菌体，随后经过乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；（2）构建LAMP扩增反应体系：DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反转录酶 10U，硫酸铝钾溶液0.3μL，dNTP 3μL，随机引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述LAMP Visible Dye为20‑40倍稀释；所述Buffer中含有NaCl、Tris‑HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸钠；所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；所述硫酸铝钾溶液的浓度为8‑15mmol/L；所述随机引物的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述聚色氨酸溶液的浓度为20‑40mmol/L；（3）扩增反应：将LAMP扩增加入到LAMP试剂盒中，随后进行扩增，60‑64℃保持1h；（4）检测分析：反应结束后，离心，肉眼观察沉淀，对样品进行定性分析；所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。