[发明专利]紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法

摘要

本发明公开了一种紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法，具体步骤包括苜蓿病株的采集与准备、病原菌的分离纯化、病原菌形态学观察、分子生物学鉴定、进化树的构建和致病性鉴定。本发明对苜蓿根腐病病原的鉴定操作简单、准确性高、简便快速；分离纯化纯度高、鉴定结果可靠，通过致病性鉴定明确了各菌株的致病性强弱。

主权项

一种紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)苜蓿病株的采集与准备对苜蓿田进行定点调查，观察根腐病的田间症状，采集具有典型症状的镰刀菌根腐病病株标样；(2)病原菌的分离纯化于病株标样的病斑处切取小块组织，经处理后，纯化到种，再将分离纯化后的镰刀菌接到培养基中保存，用于后续的菌种鉴定；(3)病原菌形态学观察菌种培养一段时间后，依据培养基上的培养性状，包括菌落形态、色泽、菌落生长速度；通过VBC和SNA限定营养缺乏培养基上对大小分生孢子的有无、分生孢子的形态及产生方式、厚垣孢子的有无及着生方式进行形态鉴定；(4)分子生物学鉴定在形态学特征鉴定的基础上对分离菌株的rDNA‑ITS区域和TEF‑1α序列进行扩增；扩增产物回收纯化，连接到载体中并转化大肠杆菌，阳性克隆送交测序，使用DNAMAN软件对测序结果进行剪切分析，剪切后在线比对分析；其中，rDNA‑ITS又称为核糖体基因内转录间隔区域，TEF‑1α又称为翻译延长因子1α基因；(5)进化树的构建将获得的ITS序列和TEF‑1α的序列分别与GenBank数据库和鉴定镰刀菌的数据库FUSARIUM‑ID中的镰刀菌的rDNA‑ITS和TEF‑1α序列进行比较，利用MEGA 5软件进行聚类分析，构建系统发育树；(6)致病性鉴定于器皿中放置大小均匀的燕麦种子，加水浸泡过夜，除去多余水分，高压灭菌；器皿中加入接种菌株的琼脂块；直至燕麦种子完全接种镰刀菌后备用；选择饱满健康的苜蓿种子，消毒后置于培养皿中催芽，播于盆中培养成植株；待植株培养一段时间后，将提前准备好的燕麦接种于植株；不接种的植株作为对照；接种后培养一段时间，观察病害情况；根据病斑占根系面积的百分比进行病害分级；统计发病率DI和病害严重指数DSI；DI＝(病株数/总株数)×100％；DSI％＝∑(各级病株数×该级代表值)/(调查总株数×最重级别代表值)×100％；切取感病根组织，消毒后接种于PSA平板上进行分离和纯化，并采用上述形态学观察和分子鉴定的方法与最初的接种物进行比较和鉴定。