[发明专利]一种棉花多基因聚合育种的分子检测方法

摘要

本发明公开了一种快速实现转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因的分子检测方法，其包括以下步骤：（1）利用卡那霉素对棉花进行抗性鉴定；（2）提取含有目的基因棉花的基因组DNA；（3）以第（1）步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增；（4）对扩增产物进行凝胶电泳；（5）对电泳结果进行分析，发现可以同时检测转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因。本发明方法技术可靠、操作简便、结果准确、成本低等有优点，有利于大规模的快速检测，对棉花高产、多抗等性状的多基因分子聚合育种具有重要意义。

主权项

一种快速实现转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因的分子检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）采用喷雾加涂抹的方法对棉花抗性进行卡那霉素鉴定；（2）提取提取含有目的基因棉花基因组DNA；（3）以第（2）步中提取的基因组DNA为模板，将FBP：：IaaM转基因系基因检测特异性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和内标基因Sad1基因引物S1，分别进行单一PCR扩增和多重PCR扩增，其中，2个SSR特征引物碱基序列为：引物B1：Cry‑F：5’‑GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC‑3’；Cry‑R：5’‑CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT‑3’；引物P1：G‑P1：5’‑ttttggtgaaattctggtctgc‑3’G‑P2：5’‑aaaacagggcttggattag‑3’（4）对扩增产物进行凝胶电泳；（5）对电泳结果进行分析：卡那霉素抗性的植株初步认定为携带有Bt基因或/和转FBP：：IaaM基因材料，进入下一步试验；分别使用引物P1、引物B1和S1的目的片段与该三对引物的多重PCR目的片段的大小一致，说明该方法结果可靠；使用引物组合B1/P1，以FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代植株、非转基因纯系为模板时，在F1的5个单株中，均可以扩增出相应的目的条带，而非转基因系则未见有扩增产物，说明B1/P1的引物组合可以同时检测FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物组合，分别以转基因抗虫棉纯系和非转基因纯系为模板，转基因抗虫棉纯系的不同单株均可以检测到Bt和Sad基因，而非转基因纯系只能检测到Sad基因，说明B1/S1的引物组合可以区分抗虫棉和非抗虫棉系。