[发明专利]一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法

摘要

本发明公开一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法。该方法包括扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得、绿色球状体的诱导、绿色球状体的增殖、绿色球状体的分化、组培苗培养和生根。本发明直接以扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导出扇蕨绿色球状体仅需为42天～50天，缩短了绿色球状体的诱导周期，且繁殖效率高，绿色球状体诱导率达96～100％，增殖倍数达6.21～7.47倍，绿色球状体的分化率达100％，生根率达100％，繁殖周期短，对于珍稀濒危植物扇蕨种群数量的扩大，以及扇蕨野生资源的可持续开发利用具有重要意义。

主权项

1.一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：(1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得选择带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片，用软的毛刷蘸1％体积分数的洗洁精水对扇蕨幼孢子囊群表面进行清洗，除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂物，直至可见黄绿色的扇蕨幼孢子囊，然后用手术刀片将扇蕨幼孢子囊群从叶片上剥离，放置于烧杯中，流动水冲洗1～1.5小时，再在无菌条件，将扇蕨幼孢子囊群用5％体积分数的次氯酸钠溶液消毒12～15分钟，无菌水冲洗5～6次，每次冲洗5分钟，即得扇蕨无菌幼孢子囊群外植体；所述扇蕨幼孢子囊为黄绿色，且孢子囊壁完整，孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊；(2)扇蕨绿色球状体的诱导将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成小块，接种于绿色球状体诱导培养基上，20℃～25℃暗培养48小时，然后转入光照培养，培养时间为40～48天，得到扇蕨绿色球状体，光照培养条件为：20℃～25℃,每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx；所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.5～1.0mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(3)扇蕨绿色球状体的增殖将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块，接种于绿色球状体增殖培养基上，培养时间为30天，得到增殖的扇蕨绿色球状体，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同；所述绿色球状体增殖培养基为：1/2MS～MS+6‑BA 0.3～0.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(4)扇蕨绿色球状体的分化将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成块，接种于绿色球状体分化培养基上，培养时间为30天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同，所述绿色球状体分化培养基为：1/4MS～1/2MS+KT0.1～0.2mg/L+水解酪蛋白100～180mg/L+活性炭1～2g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(5)扇蕨组培苗的培养和生根将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上，培养时间为60天，每30天更换一次组培苗培养和生根培养基，得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同，所述组培苗培养和生根培养基为：1/2MS～MS+NAA 0.2～0.3mg/L+活性炭1～2g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。