[发明专利]一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法

摘要

本发明是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.Sss I；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。本发明方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.Sss I，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，大大简化了重组表达过程。

主权项

1.一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：/n所述的甲基化酶是M.Sss I；/n所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI；/n该方法步骤包括：/n步骤（一）：将M.Sss I基因克隆至质粒载体pACYC184上，得到M.Sss I组成型质粒，转化宿主菌，筛选获得被甲基化保护的阳性重组菌株；具体包括：/n设计引物，根据设计的引物PCR扩增M.Sss I基因，M.Sss I的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pACYC184上，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经细胞培养后提取质粒，经测序获得M.SssI的组成型质粒pACYC184-M.Sss I，将pACYC184-M.Sss I转化大肠杆菌ER2566感受态细胞后，涂布于含氯霉素的LB平板上筛选克隆，获得M.Sss I组成型表达菌株ER2566-M.Sss I；/n步骤（二）：将所述限制性内切酶D的基因克隆至质粒载体pET-28b上，得到限制性内切酶D重组质粒，转化步骤（一）得到的已被甲基化保护的阳性重组菌，筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶D的重组表达菌株；/n具体包括：/n（1）限制性内切酶D重组表达菌株的构建/n设计引物，根据设计的引物PCR扩增限制性内切酶D基因，限制性内切酶D的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pET-28b上，限制性内切酶D基因的插入部位处于T7启动子后，经测序获得限制性内切酶D的重组质粒pET-D，将pET-D转化至ER2566-M.Sss I感受态细胞后，涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上筛选克隆，获得限制性内切酶D的重组表达菌株ER2566-M.Sss I-D；/n（2）限制性内切酶D的诱导表达/n将ER2566-M.Sss I-D涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上，培养并挑取单菌落接种于含氯霉素及卡那霉素的LB培养液中，摇动培养一段时间，加入IPTG诱导表达限制性内切酶D；/n（3）限制性内切酶D的纯化/n（a）取经IPTG诱导后的ER2566-M.Sss I-D菌培养液，离心收集菌体；/n（b）菌体以Ni柱结合缓冲液重悬后破碎处理，离心取上清粗蛋白溶液过Ni亲和层析纯化柱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析；/n（c）取步骤（b）中透析后的收集样过阴离子交换层析柱，梯度洗脱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析、贮存。/n