[发明专利]一种检测纺织品中沙门氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测纺织品中沙门氏菌的方法，包括如下步骤：步骤一：样品增菌；步骤二：LAMP试验；步骤三：MALDI‑TOF‑MS技术鉴定；步骤四：结果报告。利用该方法大大缩短了检测时间，阴性检测结果只需1天，阳性检测结果只需3天。该方法使用LAMP技术和MALDI‑TOF‑MS科学结合，既简易、经济，又具有高通量特点，适合即时、现场检测，如果现场检测为阳性，即可有目的的加大抽样实验室送检，使监管起来不但反应速度快、针对性强，而且节约时间。

主权项

1.一种检测纺织品中沙门氏菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：样品增菌用无菌的方式打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，称取剪下的样品25g剪碎后加入到盛有225mLSCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀；将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养16h±2h，得第一增菌液；步骤二：LAMP试验2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；2.2)LAMP扩增反应：2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n，取出n个LAMP反应管；扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；其中，所述的LAMP反应管数n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数；表1反应体系2.2.2)设定空白对照、阴性对照和阳性对照；空白对照：以水代替DNA模板；阴性对照：以水代替第一增菌液，按步骤2.1)的方式提取模板DNA作为所述LAMP反应的模板；阳性对照：沙门氏菌标准菌株增菌后按步骤2.1)的方式提取模板DNA作为所述LAMP反应的模板；2.2.3)加样：将步骤2.1)中制备好的DNA模板、步骤2.2.2)所得的空白对照、阴性对照和阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL；盖紧管盖，混匀，2000rpm离心10sec；2.2.4)上机反应：将步骤2.2.3)所述反应管置于水浴锅或LAMP实时浊度仪中，65℃扩增40min；2.2.5)初步观察结果：将步骤2.2.4)所述反应管置黑色背景下观察，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果结果为阴性，可直接报告样品中未检出沙门氏菌，如结果为阳性或可疑，继续进行步骤三的实验；步骤三：MALDI‑TOF‑MS技术鉴定3.1)二次增菌将步骤2.2.5)初步观察结果为阳性或可疑的样品的培养物1mL接种于装有10mL氯化镁孔雀绿肉汤的试管中，42℃±1℃培养24h±2h，得第二增菌液；另取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性或可疑的培养物1mL接种于装有10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液的试管中，36℃±1℃培养24h±2h，得第三增菌液；3.2)分离：用无菌接种环挑取步骤3.1)中的第二增菌液和第三增菌液各1环，分别划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个沙门氏菌显色培养基平板；置于36℃±1℃恒温培养箱，亚硫酸铋琼脂平板培养48h±2h，沙门氏菌显色培养基平板培养24h±2h；培养结束后观察各个平板上菌落生长情况，一种情况为：无可疑或典型菌落生长，直接报告沙门氏菌未检出；另一种情况为：有可疑或典型菌落长出，则挑取所述可疑或典型菌落纯化后，进行MALDI‑TOF‑MS技术鉴定确认；亚硫酸铋琼脂平板上沙门氏菌菌落特征棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色；有些菌株呈灰绿色，周围培养基不变或微变暗；沙门氏菌在其显色培养基上菌落特征按照显色培养基的说明进行判定，挑取2个或2个以上亚硫酸铋琼脂平板和沙门氏菌显色培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI‑TOF‑MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDIBiotyper System分析对比得出鉴定结果；3.3)配制标准品和基质：配置标准品和基质的标准溶剂为体积比50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品，加入标准溶剂50μL；使用移液器反复吹吸的方式，溶解Biotyper System粉末；室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用；基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂，振荡混匀，直到形成澄清溶液；3.4)MALDI BioTyper自动鉴定：挑取亚硫酸铋琼脂平板和沙门氏菌显色培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μL HCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干；将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果；步骤四：结果报告根据步骤二的试验，初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出沙门氏菌；初步结果为阳性或可疑的样品，按步骤三的检测结果，报告样品中检出或未检出沙门氏菌；其中，步骤2.2.1)中所述的引物为：外引物F3：5'‑TCTGAGCCAATCGTTAATCTC‑3'外引物B3：5'‑CTTAAACGGCGGTGTCTT‑3'内引物FIP：5'‑GCCTTCCATCAGCATTAACTGCTATGAGGTCCTGACGCAA‑3'内引物BIP：5'‑CATCAGAGCAACGAAGCATTGCATATCTGGTAATATGGCTGGC‑3'环引物LoopF：5'‑TCGCTATCATGTTCTGACGG‑3'环引物LoopB：5'‑TGGTGCAACGATGGAACA‑3'。