[发明专利]一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法

摘要

本发明公开一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，包括如下步骤：受试物前处理、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液浓度计算、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种、受试物分组、受试物检测剂量的设定、受试物培养品的制备、受试物培养品的低渗、受试物培养品滴片的制备等步骤。本发明综合考察电子烟制品的使用特点、作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞作为电子烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的体外微核试验检测方法。

主权项

1.一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h‑48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，‑80℃保存待用；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育1‑2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物的分组：将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加环磷酰胺溶液；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；(6)受试物检测剂量的设定：根据细胞毒性测定的IC50值设定检测剂量，将受试物，即电子烟原液分为4个非零剂量：IC50、1/2IC50、1/4IC50、1/8IC50；(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+环磷酰胺溶液；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，每孔总体积为2mL，将加好样的6孔板置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养24h，之后加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；(8)受试物培养品的低渗：将步骤(7)收集的受试物培养品置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；(9)受试物培养品滴片制备：取出步骤(8)中的离心管并移除大部分上清液，留少许上清液并轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每一孔滴3张玻片；(10)受试物培养品滴片的染色：将步骤(9)晾干后的玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后，用自来水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；(11)受试物培养品微核的观察：根据步骤(10)所得到的微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；(12)受试物培养品结果判定：将受试物培养品与对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系，即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。