[发明专利]基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法

摘要

基于G‑四链体‑血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，属于分析化学技术领域。本发明设计了捕获探针和辅助探针，辅助探针两端均含能与目标DNA互补的核酸序列，而中间含有能形成G‑四链体的碱基序列。捕获探针与目标DNA相互识别，发生连续的聚合链式反应，形成链状聚集体，并被金电极表面的捕获探针固定至电极，在电极表面引入大量G‑四链体结构。随后G‑四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物，通过差分脉冲伏安法（DPV）扫描得到的电化学信号与电极表面的G‑四链体‑血红素复合物，以及体系中加入的目标DNA浓度存在对应关系，实现对目标DNA的检测。用该方法对样品中的HIV DNA进行检测，取得了理想的效果。本发明方法具有灵敏度高、特异性强的优点。

主权项

1.一种基于G‑四链体‑血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其将捕获探针固定到金电极上，然后将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交，电化学法检测响应电流值；具体步骤如下：（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2‑3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从‑0.4V至+1.5V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的CV图为止；将处理后的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；（2）捕获探针的固定：将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解，‑20℃冰箱中保藏；将捕获探针用PBS缓冲液稀释；将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤（1）处理所得金电极上，使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭金电极4h，得到修饰有捕获探针的金电极；用超纯水淋洗电极，氮气吹干待用；（3）捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交：将步骤（2）所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2h；所述反应体系为：0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液；（4）G‑四链体‑血红素复合物的形成：将200μL的G‑四链体形成液倒扣在电极上，室温下放置30min；向G‑四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；（5）电化学检测：a、电化学反应：采用三电极系统，步骤（4）所得金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为含pH 7.4、20 mM KCl的20 mM HEPES缓冲液，检测前先通入氮气30 min；b、标准曲线的绘制：检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围‑0.6～‑0.15 V，振幅50 mV；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）‑（4）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线；c、检测：对于未知浓度目标DNA样品，按上述步骤（1）‑（4）同样操作后对其进行检测，测得峰电流后从标准曲线可读出其浓度值；其特征在于：所述辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G‑四链体的碱基序列，具体为5’‑目标序列后11个碱基的互补序列+ TTTGGGTAGG GCGGGTTGGG CT+目标序列前11个碱基的互补序列‑3’；所述捕获探针具体为5’‑HS‑（CH2）6‑TT+目标序列前11个碱基的互补序列‑3’。