[发明专利]一种溶血性链球菌含量检测方法

摘要

本发明公开了一种溶血性链球菌含量检测方法，包括以下步骤：（1）提取待溶血性链球菌样本基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5‑10min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设5‑7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3‑5个重复样，于37℃培养18‑24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液。本发明方法能克服传统的检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短到2‑3天，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。

主权项

一种溶血性链球菌含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待溶血性链球菌样本基因组DNA：称取3g待检样品到盛有27mLGN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5‑10min，混合均匀得混合物；取0.5mLGN增菌液稀释混匀的混合物加入到经过灭菌的4.5mLGN增菌液中得到各个稀释梯度，设5‑7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3‑5个重复样，于37℃培养18‑24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（2）选择性增菌培养：移取步骤（1）所得各管中菌液0.5mL加入到溶血性链球菌增菌肉汤中，37℃培养18‑24h；（3）DNA提取：移取步骤（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间‑20℃保存；（4）PCR预扩增：以步骤一提取的待溶血性链球菌样本的基因组DNA作为模板，使用PCR预扩增引物对提取的肺炎链球菌标本基因组DNA进行预扩增；MLPA探针杂交、连接、扩增：使用MLPA探针对待溶血性链球菌样本基因组DNAPCR预扩增产物进行杂交,同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针；用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针；MLPA产物检测：使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物。