[发明专利]一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，包括如下步骤：选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1‑SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液。本发明方法能克服传统检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。

主权项

一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：①选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1‑SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的小肠结肠炎耶尔森菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQIDNo：1‑SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM‑Teasy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置‑20℃备用；③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNaseH酶——TliRNaseHII用量的优化；D.TaqDNA聚合酶——ExTaqHS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。