[发明专利]白三叶的组织培养及快速繁殖方法

摘要

提供一种白三叶(Trifoliumrepens L.)无菌苗组织培养及快速繁殖的方法，该方法包括取白三叶的种子进行消毒、诱导分化、壮苗、生根培养及移栽等步骤。通过本发明的方法，繁育的白三叶无菌苗在两月内可增殖系数为20，丛生芽诱导分化率为95％，平均生根率为99％，平均移栽成活率为97％，极大地提高了白三叶的繁殖系数，建立了高效稳定的无菌苗组织培养及快速繁殖技术，为白三叶种苗脱毒、进行白三叶基因工程改良及种质创新研究提供有效的繁殖方法。

主权项

1.白三叶的组培繁殖方法，该方法包括取白三叶的种子进行消毒、选取外植体、诱导分化、壮苗、生根培养、移栽步骤，其中诱导分化培养基为MS+B54.4g/L+BAP l.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L；壮苗培养基为MS+B54.4g/L+BAP 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L；生根培养基为MS+B5 4.4g/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L；所述的消毒和选取外植体步骤是将白三叶种子放入到15ml的离心管里，用70％酒精浸泡1min，用5％次氯酸钠浸泡5min，无菌水冲洗4遍，用无菌水浸泡在17℃下过夜，在超净工作台上、实物显微镜下，切去胚根，保留子叶及基部2‑3mm，剥去外种皮，沿两片子叶内侧纵劈胚轴作为外植体；所述的诱导分化、壮苗、生根培养、移栽步骤是将切好的带有2‑3mm胚轴的子叶放入上面带有灭菌滤纸的诱导分化培养基MS+B54.4g/L+BAP l.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L上，培养条件为温度26℃，光照16h，光照强度2000Lx，培养3天后，将绿色的子叶分散放入到无滤纸的诱导分化培养基上，相同的培养条件，培养14天后，将带有丛生芽的子叶再次转入到新的诱导分化培养基上，相同的培养条件培养14天；然后把培养的丛生芽上黄色老的子叶切除后，将绿色的丛生芽转入壮苗培养基MS+B54.4g/L+BAP 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L+Timentin 300mg/L+Cefotaxime 300mg/L上，培养条件为温度26℃，光照18h，光照强度2000Lx，培养14天；将生成3～4cm高的无根小苗分割开，移入生根培养基MS+B5 4.4g/L+蔗糖40g/L+琼脂8.0g/L上，培养条件为温度26℃，光照18h，光照强度2000Lx，培养20天，当试管苗出现3‑5条粗根，根长3‑5cm，苗高5cm以上时移栽，先打开封瓶膜，经3～5天锻炼，移入混有灭过菌的营养土即园土:腐殖土:砂土＝2:2:1和适量珍珠岩的培养盘内，最初7天用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80％，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。