[发明专利]一种可溶性ST2的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法有效
申请号: | 201611077983.4 | 申请日: | 2016-11-30 |
公开(公告)号: | CN106556705B | 公开(公告)日: | 2019-01-18 |
发明(设计)人: | 兰成杰;单存海;陶剑 | 申请(专利权)人: | 天津康尔克生物科技有限公司 |
主分类号: | G01N33/68 | 分类号: | G01N33/68;G01N33/531 |
代理公司: | 北京市商泰律师事务所 11255 | 代理人: | 毛燕生 |
地址: | 301706 天*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | 本发明公开了一种可溶性ST2酶联免疫检测试剂盒,检测试剂盒包含有样本稀释液、洗涤液、显色液及终止液、酶标记物,所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的可溶性ST2单克隆抗体,所述检测试剂盒还包括:多个不同浓度的可溶性ST2标准品、可溶性ST2质控品、以及微孔反应板,所述微孔反应板包被可溶性ST2单克隆抗体。本发明的可溶性ST2酶联免疫检测试剂盒,试剂盒中的多种不同浓度的可溶性ST2标准品无需进行稀释处理可以直接使用,简化了操作步骤,缩短了检测时间,实现了高效、快速检测,同时可溶性ST2质控品可以鉴定检测结果是否准确,多个不同浓度的可溶性ST2标准品可以得到不同规格的检测试剂盒,适应不同客户的使用需求。 | ||
搜索关键词: | 一种 可溶性 st2 免疫 检测 试剂盒 及其 制备 方法 | ||
【主权项】:
1.一种可溶性ST2酶联免疫检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包含有样本稀释液、洗涤液、显色液及终止液、酶标记物,所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的可溶性ST2单克隆抗体,所述检测试剂盒还包括:多个不同浓度的可溶性ST2标准品、可溶性ST2质控品、以及微孔反应板,所述微孔反应板包被可溶性ST2单克隆抗体;所述多个不同浓度的可溶性ST2标准品为6个不同浓度的可溶性ST2标准品;所述6个不同浓度的可溶性ST2标准品的浓度依次为0ng/ml、6.4ng/ml、16ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml;所述可溶性ST2标准品的制备方法为:以胎牛血清处理基质对人可溶性ST2重组抗原进行稀释,配制得到可溶性ST2标准品;所述胎牛血清处理基质的制备方法为:取适量研细后的硫酸铵于18‑25℃下边搅拌边加入胎牛血清中,使其终浓度为100~300g/L,4℃放置18~22小时;10,000转离心20~40分钟,取上清液滤纸过滤;将滤后上清液装透析袋,于4℃下在10倍体积的生理盐水中透析,每隔3~5小时更换一次透析液,一共三次;转入10体积的0.05mol/L硼酸溶液中进行透析,每隔3~5小时更换一次透析液,一共四次;将透析后的液体放入干净容器内,于56℃热灭活1~2小时;加入0.05~0.15%的Proclin300和0.05~0.15%的庆大霉素,混合均匀后用0.22μm滤膜过滤除菌得到胎牛血清处理基质,于‑20℃下保存待用;所述可溶性ST2酶联免疫检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:步骤1、制备可溶性ST2标准品和可溶性ST2质控品:使用胎牛血清处理基质将人可溶性ST2重组抗原稀释得到6个浓度的可溶性ST2标准品,同时使用胎牛血清处理基质将人可溶性ST2重组抗原稀释得到低值范围质控品和高值范围质控品;步骤2、制备可溶性ST2单克隆抗体包被的微孔反应板:吸取适量可溶性ST2单克隆抗体,加入0.01mol/L,pH=7.2的磷酸盐溶液中进行稀释,使其终浓度为2~6μg/mL,4℃储存备用;取微孔板,每孔加入100μL稀释后的可溶性ST2单克隆抗体,覆膜后置于4℃包被18~22小时;甩去孔内液体,每孔加入200μL内含1~3%牛血清白蛋白、3~5%蔗糖、0.05~0.15%Priclin300的0.01mol/L,pH=7.4的磷酸盐溶液,覆膜后置于4℃封闭18~22小时;甩去孔内液体,并在吸水纸上拍干,18‑25℃下干燥2~4天后真空密封包装,得到可溶性ST2单克隆抗体包被的微孔反应板,所述微孔反应板保存于4℃;步骤3、制备辣根过氧化物酶标记的可溶性ST2单克隆抗体:①称取辣根过氧化物酶2mg,溶解于1mL去离子水中,加入1~2mL浓度为0.05mol/L的过碘酸钠溶液,4℃缓慢摇动30~60min;②用浓度为0.001mol/L,pH=4.4的醋酸钠溶液透析18~22小时;③加入2mg可溶性ST2单克隆抗体,4℃避光振荡18~22小时;④加入400μL浓度为0.2mol/L的NaBH4溶液,用浓度为0.02mol/L,pH=7.4的磷酸缓冲液透析18~22小时;⑤用HPLC二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油,得到辣根过氧化物酶标记的可溶性ST2单克隆抗体,于‑20℃保存;步骤4、制备样本稀释液:取磷酸二氢钠1.409g、磷酸氢二钠4.372g、氯化钠8.5g、牛血清白蛋白5g、吐温‑20 0.5mL、加水定容至1L,用氢氧化钠调pH至7.4±0.1;步骤5、制备洗涤液:取磷酸二氢钠28.18g、磷酸氢二钠87.44g、氯化钠170g、吐温‑20 10mL,加水定容至1L,使用时用水稀释20倍;步骤6、制备显色液:(1)称取100g TMB,用10mL DMSO和10mL无水乙醇配成的混合液溶解,4℃避光保存备用;(2)配制0.1mol/L pH4.0~5.0的柠檬酸溶液;(3)向1000mL所述步骤⑵配制的柠檬酸溶液中加入100~200mg过氧化氢尿素;(4)溶解充分后,加入PVP,使其终浓度为0.2~0.6%,4℃放置18~22小时;(5)加入所述步骤⑴事先溶解的TMB混合液,并加入2~4%聚乙二醇,加水定容至1000mL,4℃避光保存;步骤7、制备终止液:量取50mL浓硫酸沿烧杯壁缓慢地注入870mL水中,混匀,使其被稀释18.4倍,4℃保存;或选用浓度为1mol/L的盐酸作为终止液;所述低值范围质控品和高值范围质控品的浓度分别为30ng/ml、60ng/ml;所述可溶性ST2质控品包括低值范围质控品和高值范围质控品,所述质控品的制备方法为:以胎牛血清处理基质对人可溶性ST2重组抗原进行稀释,配制得到可溶性ST2质控品;所述可溶性ST2酶联免疫检测试剂盒的使用方法为:(1)实验所需试剂及样本从冰箱中取出,在18‑25℃下平衡30分钟;(2)取一块微孔反应板,取出实验所需板条置于板架上,进行编号;(3)取各个浓度的标准品、质控品及实验样本20μL分别加入相应编号的孔中;(4)每孔加入80μL样本稀释液,振荡混匀30秒后覆膜并于37℃温育60分钟;(5)除去孔内液体,每孔加入300μL事先20倍稀释的洗涤液,振荡30秒后除去洗液,重复4次,拍干残留液体;(6)每孔加入100μL酶标记物,振荡混匀30秒后覆膜并于37℃温育30分钟;(7)除去孔内液体,每孔加入300μL事先20倍稀释的洗涤液,振荡30秒后除去洗液,重复4次,拍干残留液体;(8)每孔加入100μL显色液,混匀,37℃避光温育20分钟;(9)每孔加入50μL终止液,振荡混匀30秒后用酶标仪在450纳米波长条件下测定各孔的OD值;(10)以吸光度OD值为纵坐标,相应的可溶性ST2标准品浓度为横坐标,通过四参数拟合方程做得相应的曲线,根据样本的OD值计算从标准曲线上读取样本中含有的ST2的含量。
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