[发明专利]一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌进行表达的无抗表达系统及构建方法。其将利用低背景的木糖操纵子诱导表达的T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再专一性转录T7启动子后目的基因的级联放大表达系统转入芽孢杆菌基因组中，并且删除了中间使用的筛选标记基因。其克服了抗生素筛选标记基因易发生漂移，质粒表达系统不稳定，表达不可诱导表达量不高的缺点，建立了一种低背景可控诱导且高效表达的无抗表达系统。结合枯草芽孢杆菌表达系统本身发酵成本低，可规模化生产，发酵产物可分泌到发酵液中，不含有内毒素等优点，给表达目的蛋白提供了一种全新的表达系统。

主权项

1. 一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统，其特征在于：将表达系统元件插入芽孢杆菌的基因组中，删除抗性标记元件，建立无抗的表达系统，所述表达系统为木糖操作子—T7 RNA聚合酶的级联放大表达系统；其构建方法包括以下步骤：(1)PCR扩增wprA基因上游602bp片段wprA‑F和wprA基因下游601bp片段wprA下游片段wprA‑R，全基因合成xylR操纵子的xylR基因启动子及CDS区域和xylAB的启动子区域，全基因合成T7 RNA聚合酶基因的CDS片段，通过同源重组构建载体pBTS‑T7RP；所述pBTS‑T7RP核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； (2)转化pBTS‑T7RP质粒进入菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在wprA‑F和wprA‑R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有xylR‑T7RP片段的菌株ZT7RP；(3)PCR扩增xylAB基因上游片段xyl‑F和xylAB基因下游片段xyl‑R，全基因合成T7启动子、xylR结合位点、RBS位点、多克隆位点和T7终止子片段，通过同源重组，构建pBTS‑FR载体；所述pBTS‑FR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； (4)通过PCR扩增或者全基因合成任一需要表达的基因片段，通过酶切或者同源重组等方式插入到pBTS‑FR的多克隆位点，构建表达载体pBTS‑FR‑X； (5)转化pBTS‑FR‑X质粒进入ZT7RP菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在xyl‑F和xyl‑R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有PT7‑X‑T7ter片段的菌株Z‑X；(6)接种Z‑X到培养基中，培养温度为25‑40℃，接种后0‑8h加入0.01%‑1%浓度的木糖进行诱导，培养时间>=12h后，即得菌体或者发酵液中的目标蛋白。