[发明专利]一种创伤弧菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种创伤弧菌的检测方法，包含以下步骤，A、检测样品制取，B、基因提取，C、25ul反应体系配制，D、多重荧光PCR反应，E、数据分析；本发明采用了创新的细菌富集试剂技术、DNA提取试剂技术、特异性荧光探针杂交PCR检测技术以及多重PCR技术，样本无需增菌培养，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。本发明的有益效果主要体现在无需样本前增菌，细菌的检测敏感性高、特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现同时对创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌的快速、准确、特异检测。

主权项

一种创伤弧菌的检测方法，其特征在于，包含以下步骤，A、检测样品制取：将待检测的样本；在无菌条件下与细菌富集试剂按100：1的比例充分混合，13000rpm离心20分钟，然后弃去上清，加入0.5ml的质量百分浓度0.5%的无菌生理盐水将沉淀物充分打散得到细菌富集液；B、基因提取：取50ul细菌富集液及50ul所述DNA提取试剂于1.5ml离心管中，振荡混匀后，96‑100℃水浴10min，13000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，‑20℃环境下储存备用；C、25ul反应体系配制:取2ul所述DNA模板至PCR管中，加入22.6ul多重荧光PCR反应母液和0.4ul浓度5U/ul的TaqDNA聚合酶，进行多重荧光PCR扩增；D、多重荧光PCR反应：在荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为：ROX、HEX、FAM及CY5通道；E、数据分析：通道中出现S形扩增曲线，Ct值小于37为对应弧菌阳性，没有出现S形扩增曲线，或者有扩增曲线但不呈S形、阈值超过40为阴性，出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为创伤弧菌可疑，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验仍出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为创伤弧菌阳性。