[发明专利]一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法

摘要

本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hBMP‑2的cDNA序列，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hBMP‑2基因的DNA序列；通过截取编码rhBMP‑2羧基端氨基酸肽段的rhBMP‑2的cDNA制备大肠杆菌rhBMP‑2菌株，通过发酵及工艺优化，获得BMP包涵体，经分离纯化与复性，制得高纯度的rhBMP‑2。

主权项

一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hBMP‑2的cDNA序列，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hBMP‑2基因的DNA序列；（2）全基因合成hBMP‑2基因DNA序列，酶切后插入载体pBV220，获得优化的hBMP‑2表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计相符；（3）先以常规氯化钙法采用分子克隆技术制备感受态表达系统，随后用所得的表达质粒转化大肠杆菌菌株，在抗性平板中挑取单菌落，培养并抽提质粒，酶切测序；（4）挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在气浴振荡器中培养15h，温度30℃、转速180r·min，然后冰浴条件下加入无菌甘油，分装后在80℃冰箱保存，备用；（5）从含正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液摇瓶中；在摇床中培养8h温度30℃、转速180r·min，再按体积比为1:10的比例将培养物接种到LB培养基中培养4h，条件：pH7.0±0.2，温度30℃，转速180r·min；（6）随后升温至42℃进行诱导，继续培养6h；（7）结束培养，在（4±2）℃温度下离心分离（转速7500r·min−1）收集菌体，裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；（8）将收集的菌体，与TE缓冲溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，离心分离（转速10000r·min−1）并收集沉淀；（9）加入洗涤溶液（1g沉淀物/20ml洗涤液），搅拌2h后，在（4±2）℃下离心分离，收集沉淀物；（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗涤数次后，加入10mmol·L−1的Tris（pH7.5）溶液（1g沉淀物/20mlTris），清洗后离心收集沉淀，得包涵体；（11）包涵体/10ml的比例加入裂解液；在（4±2）℃下，搅拌裂解8h，然后离心[转速10000r·min−1，温度（4±2）℃]30min，弃沉淀，取离心上清液加入含复性助剂的复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg·ml−1，复性7d；（12）从复性液中回收有活性的融合蛋白二倍体，然后在30～7℃下冻干，得到目标蛋白。