[发明专利]一种生长激素受体激活剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种生长激素受体激活剂的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤用含体积分数10％灭活胎牛血清、青霉素100IU/mI.链霉素100IU/mL的RP—MI一1640培养基培养CHO～GHR638细胞，培养条件37℃、体积分数5％二氧化碳；本发明所述方法制备的生长激素受体激活剂，激活了胞内信号通路蛋白JAK2、STAT5、ERKl／2，表现出生长激素样的活性，这为进一步探索生长激素类似物提供了新的方向。

主权项

一种生长激素受体激活剂的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：（1）用含体积分数10％灭活胎牛血清、青霉素100IU/mI.链霉素100IU/mL的RP—MI一1640培养基培养CHO～GHR638细胞，培养条件37℃、体积分数5％二氧化碳；（2）选取6周龄雌性鼠6只，首免以100毫克GHBP与等体积弗氏完全佐剂乳化后免疫BALB/c鼠，免疫剂量为50毫克/只，并以14d为问隔进行加强免疫，剂量与首免相同，不同的是与弗氏不完全佐剂乳化，每次加强免疫后3d采尾静脉血测效价，直至效价达到1：20000以上时，取鼠脾脏细胞与SP2/O融合；（3）将融合后的细胞分散于96孔细胞培养板中，经含有HAT的培养基筛选培养10d后，利用间接ELISA筛选阳性克隆，将阳性克隆转移到20孔培养板，扩大培养；（4）取ELISA检测阳性孔上清液500肚L与CHO—GHR638(细胞密度为1x104mI.‑1)4℃孵育30min，以ELISA检测阴性孔同样处理作对照，PBS洗涤细胞3次，洗涤后1000r/min离心10min沉淀细胞并加入FITC标记羊抗鼠IgG抗体(二抗)(1：200稀释)，37℃光孵育30min；（5）然后用PBS洗涤细胞，进行流式细胞仪检测，通过CellQuest软件分析流式数据，扩大培养经3次流式检测均为阳性的杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生腹水的方法制备腹水，采用辛酸一饱和硫酸铵法纯化腹水，纯化后的抗体(IgO)保存备用；（6）用无血清RPMI‑1640培养基调整细胞密度为1000每毫升在37℃平衡30min；（7）将FITC—GH(60ng/mL)分别与2，4，6，8，10，12，14，16，18，20ng/mL的未标记GH或纯化的抗GHR抗体混合，并与CHO—GHR638细胞4℃共孵育60min，PBS洗涤2次后，将各组细胞分别用500毫升，PBS重悬，并移入流式管中静置后即得。