[发明专利]对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法

摘要

本发明涉及一种对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法，包括仿生亲和材料的制备及其采用对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱对金属蛋白酶MP的仿生亲和纯化。该纯化方法流程简单，周期短，效率高，纯度高达98.7％。

主权项

一种对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法，包括以下步骤：1)、合成对氨基苯甲脒仿生亲和材料(1)、表氯醇活化琼脂糖凝胶用双蒸水按1：10V/V的比例对琼脂糖凝胶进行彻底洗涤，直到流出的溶液的pH达到7.0，洗涤过的琼脂糖凝胶风干后再溶解在活化溶液中，在40℃摇床中100rpm震荡2.5h进行活化，得到表氯醇活化琼脂糖凝胶6B，所述活化溶液为1M的氢氧化钠、2.5g二甲基亚砜以及10ml表氯醇；(2)、表氯醇活化琼脂糖凝胶的氨基化将35％饱和氨添加到表氯醇活化后的琼脂糖凝胶6B中，再加入一定量双蒸水，在30℃摇床中100rpm孵化过夜，使得活化琼脂糖凝胶6B加入氨基，得到氨基化活化琼脂糖凝胶6B；(3)、连接氰尿酰氯连接臂将氨基化活化琼脂糖凝胶6B按等体积加入50V/V％丙酮，在冰浴搅拌的条件下以0.5ml/min的流速缓慢加入氰尿酰氯溶液，用1M的氢氧化钠溶液调节该溶液的pH值至7.0，再用50V/V％丙酮洗涤去除多余的浮游氨基基团，氰尿酰氯连接臂连接至活化琼脂糖凝胶6B上，得到连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基；(4)、螯合对氨基苯甲脒配基将上述步骤(3)的过饱和的连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基溶解在2M的碳酸钠溶液中，然后在碳酸钠溶液中缓慢添加琼脂糖凝胶，室温搅拌24h，用双蒸水洗涤凝胶，保存在0.02W/V％的叠氮钠，得到仿生亲和材料；2)、仿生亲和材料的纯化(1)洗涤并平衡对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱上样前，用5‑10个柱体积的用0.22μm过滤过的双蒸水洗涤琼脂糖凝胶，然后用5‑10个柱体积的100mMpH 7.4的Tris‑HCl缓冲液的上样缓冲液平衡柱子，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述上样缓冲液为100mM pH 7.4的Tris‑HCl缓冲液；(2)洗涤去除杂蛋白取10mg/ml金属蛋白酶MP粗品1ml，上样至按2)、(1)中平衡过的苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱，上样时流速不大于1ml/min，用洗脱缓冲液1洗涤5‑10个柱体积，去除杂蛋白，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗脱缓冲液1为100mM的NaCl的100mM pH 7.4的Tris‑HCl缓冲液；(3)获得蛋白酶MP纯蛋白按照步骤2)、(2)去除杂蛋白之后，用洗涤缓冲液2洗脱，收取活性峰，为金属蛋白酶MP的纯酶，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗涤缓冲液2为500mM的NaCl的100mM pH7.4的Tris‑HCl缓冲液；(4)洗涤并保存柱子在获得蛋白酶纯酶之后，用洗涤缓冲液3洗涤柱子，去除牢固结合在柱子上的蛋白，再用0.22μm过滤过的双蒸水冲洗5‑10个柱体积，去除洗涤缓冲液中的各种盐离子，再用20％乙醇保存柱子，所述洗涤缓冲液3为2M的NaCl的100mM pH 7.4的Tris‑HCl缓冲液；经上述步骤后，蛋白酶活性回收率为35.7％，蛋白纯度为98.7％。