[发明专利]一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法

摘要

本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。

主权项

1.一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统，其特征在于，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统；其中，所述红色荧光蛋白稳定表达的方式为：以Stop终止子序列去除的Ai9‑dtomato表达载体转染Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP；所述绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的方式为：42230‑Kiss1和pKiss1‑2A‑EGFP共转染Cas9‑GT1‑7细胞，2A‑EGFP定点敲入的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞；构建42230‑Kiss1载体的方法为：使用sgRNA在线设计软件在小鼠Kiss1的终止密码子附近设计sgRNA CAGGCGGCGCGGGCAGCACG；合成42230质粒所需的sgRNA插入片段单链42230‑Kiss1‑F和42230‑Kiss1‑R，经过退火后将其插入42230相应位点；构建pKiss1‑2A‑EGFP的方法为：A构建5’同源臂插入的pKiss1‑5’arm载体；B构建2A‑EGFP序列插入的pKiss1‑5’arm‑2A‑EGFP载体；C构建3’同源臂插入的pKiss1‑2A‑EGFP载体；Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建方法为：42230‑Kiss1和pKiss1‑2A‑EGFP共转染Cas9‑GT1‑7细胞。