[发明专利]一种培养CD19CAR-iNKT细胞方法及用途

摘要

本发明涉及靶向CD19CAR‑iNKT细胞及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列和其活化培养及其用途，选自：(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明还提供iNKT细胞的活化及其培养方法以及应用范围。

主权项

1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列和任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，

所述多核苷酸序列在所述抗CD19单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1‑21位氨基酸所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22‑128位氨基酸所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第144‑263位氨基酸所示；和/或

所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第264‑310位氨基酸所示；和/或

所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第311‑332位氨基酸所示；和/或

所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第333‑380位氨基酸所示；和/或

所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第381‑491位氨基酸所示。

3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，

在所述抗CD19单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1‑63位核苷酸序列所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第64‑384位核苷酸序列所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第430‑789位核苷酸序列所示；和/或

所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第790‑930位核苷酸序列所示；和/或

所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第931‑996位核苷酸序列所示；和/或

所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第997‑1140位核苷酸序列所示；和/或

所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1141‑1473位核苷酸序列所示。

4.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白编码序列；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化INKT细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；

优选地，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体FMC63。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：

所述融合蛋白在所述抗CD19单链抗体的N端还含有信号肽，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1‑21位氨基酸所示；

所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22‑128位氨基酸所示；

所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第144‑263位氨基酸所示；

所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第264‑310位氨基酸所示；

所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第311‑332位氨基酸所示；

所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第333‑380位氨基酸所示；

所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第381‑491位氨基酸所示。

6.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求1‑3中任一项所述的多核苷酸序列；

优选地，所述核酸构建物为载体；

更优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，以及权利要求1‑3中任一项所述的多核苷酸序列。

7.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求6所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

8.一种基因修饰的iNKT细胞或含该基因修饰的iNKT细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求1‑3中任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求6所述的核酸构建物，或感染了权利要求7所述的逆转录病毒。

9.权利要求8中基因修饰iNKT细胞活化方法和培养方式及其应用。

10.权利要求1‑3中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求4‑5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸构建物或权利要求7所述的逆转录病毒在制备活化的iNKT细胞中的应用。

11.权利要求1‑3中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求4‑5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸构建物、权利要求7所述的逆转录病毒、或权利要求8所述的基因修饰的iNKT细胞或其药物组合物在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途；

优选地，所述CD19介导的疾病为白血病、淋巴瘤。