[发明专利]牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液。本发明的方法可以得到质量好、增殖产量高的稳定的牛大力悬浮细胞，为牛大力有效成分的开发和利用，以及为牛大力进一步利用体细胞杂交、遗传转化和突变体诱导等生物技术方法创造新的种质资源提供了新的途径和方法。

主权项

1.一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液；所述诱导培养的方法如下：将培养材料接种至诱导培养基上于黑暗条件、24-28℃下诱导培养20-30天得到诱导愈伤组织；所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；所述继代培养的方法如下：将诱导愈伤组织转接至增殖培养基上于黑暗条件下进行继代培养2-4次，至获得继代愈伤组织，每次继代培养的时间为7-10天，培养温度为24-28℃；所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；所述悬浮细胞培养的方法如下：将2-5g继代愈伤组织接种至含有100-150ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转动频率为90-100r/min、温度为28℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10-15天转接培养一次，转接培养3-6次后，得到稳定的牛大力悬浮细胞培养液；所述转接培养即将三角瓶中的悬浮液用灭菌后的150目尼龙网过滤，将滤液转接至含有100-150ml新的液体培养基的三角瓶中置于恒温摇床上继续培养；所述液体培养基为MS培养基调整得到，其将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整为硝酸铵300～500mg/L、硝酸钾2000～2500mg/L、无水氯化钙50～80mg/L、七水硫酸镁400～500mg/L、四水硫酸锰10～25mg/L，将磷酸二氢钾更换为磷酸氢二钠150～200mg/L，其余组分不变，然后再添加2,4-D 1～5mg/L、KT 0.5～0.75mg/L、TDZ 0.5～1mg/L、NAA0.2～0.5mg/L、PVP 200～300mg/L、葡萄糖25～30g/L、椰子汁100～150mg/L、茉莉酸甲酯10～200μmol/L，pH 5.8。