[发明专利]CRISPR-Cas9体外敲除耐药基因mcr-1的方法及其专用细胞穿透肽

摘要

本发明提供了一种CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽，即首先依据mcr‑1耐药基因sgRNA识别区的靶点序列构建CRISPR‑Cas9系统，靶点序列的碱基序列如SEQ NO.1所示，所构建CRISPR‑Cas9系统中，是将T7启动子插入sgRNA转录起始位点前，构建Cas9蛋白的原核表达载体，以T7启动子进行调控，接着利用专用细胞穿透肽CPP5a将mcr‑1耐药基因敲除载体pCas9‑mcr带入微生物细胞内，所述微生物种类可以为革兰氏阴性细菌，以实现在体外敲除微生物mcr‑1耐药基因。

主权项

1.一种CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法，其特征在于，具体步骤如下：A）按照SEQ ID NO.5合成DNA序列并进行退火处理，获得杂交双链；所述的退火处理是指：退火体系：浓度为100μM的合成DNA1μL，10xPCR Buffer 1μL，加水补足10μL；退火过程：95℃变性5min，之后在以2℃每分钟的速率降温至25℃，完成反应；B）利用BsaI酶切载体pCas9；C）利用T4连接酶连接杂交双链与酶切后的载体pCas9，获得载体pCas9‑mcr；D）将载体pCas9‑mcr、细胞穿透肽CPP5a与含耐药基因mcr‑1的微生物混合，4‑37℃环境中共同孵育，即实现对微生物中耐药基因mcr‑1的敲除；所述细胞穿透肽CPP5a的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述孵育是指：将终浓度为0.1‑1μg/ml的载体pCas9‑mcr、终浓度为5‑45μg/ml的细胞穿透肽CPP5a以及终浓度为10⁸个/ml的微生物混合，于4‑37℃环境中共同孵育6小时以上。