[发明专利]一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法

摘要

本发明涉及一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤选择鱼类神经坏死病毒RNA2基因序列的特异性区段，使用软件设计发夹型探针，在探针的5'端用巯基进行修饰，在探针的3'端用Cy3标记，所述探针序列为5'‑dithiol‑A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG‑Cy3‑3，本发明所述方法制备的纳米探针生物学性能良好，可用于SERS 法检测鱼类神经坏死病毒。本研究为应用纳米探针技术检测水生动物病原做了有益的探索，基于纳米探针的检测技术有望成为一种快速检测水产病原微生物的方法。

主权项

一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤：（1）选择鱼类神经坏死病毒RNA2基因序列的特异性区段，使用软件设计发夹型探针，在探针的5'端用巯基进行修饰，在探针的3'端用Cy3标记，所述探针序列为：5'‑dithiol‑A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG‑Cy3‑3，下划线部分是探针的臂端，中间部分为鱼类神经坏死病毒的特异性序列，构成探针的环区；（2）将10ml20mM的硝酸银溶液迅速倒入90mL含有1.67mM的盐酸羟胺和3.3mM氢氧化钠的混合液中，同时磁力搅拌；（3）将制得的纳米银溶胶分为两组，一组置于室温下，另一组置于4℃冰箱中，均避光保存；（4）将1μM巯基化的发夹型探针和1mM的MgCl2溶液充分混匀，室温避光条件下静置5h左右；（5）加入等体积的纳米银溶胶，混匀，在摇床上轻微摇晃1d，加入少量NaCl溶液，使其终浓度为5mM，静置1d；（6）重复3次加NaCl溶液；然后加入6‑巯基‑1‑己醇使其终浓为1mM，混匀静置10min，以置换掉非特异结合的发夹型探针；（7）以13400r/m离心15min，取沉淀用20mMTris‑HCl，将pH调至8.0缓冲液重新悬浮；离心过程重复三次；（8）取制备好的纳米探针Ag‑NNV，加入巯基乙醇使其终浓度为1mM，混匀静置24h，将结合于纳米银颗粒上的NNV发夹型探针置换出，即得。