[发明专利]一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法

摘要

本发明公开了一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。本发明的特征在于利用In‑cell Western(ICW)法简便、直观地检测被HTNV感染的细胞。该方法检测灵敏度高(可检测5g的目的蛋白)、周期短(72小时)、结果判读客观、可重复性好、高通量、方法可标准化，便于实验室间推广，特别可针对无细胞病变效应病毒检测其感染力。本发明同时公布了上述方法在HTNV感染力测定(TCID₅₀)、HTNV中和抗体效价测定、抗HTNV分子筛选和鉴定、人HTNV疫苗免疫保护性评价等方面的应用。

主权项

1.一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，包括以下操作：1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，接种细胞数为(2‑4)×10⁴/孔，接种孔数＝待测样本数×稀释次数×复孔数，培养至80～90％的细胞汇合度；2)待步骤1)中细胞汇合度达到70～80％时，采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液的制备：将待测样本等比梯度稀释，每个稀释比例的待测样本分别与等体积的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期间轻柔地颠倒混匀数次；3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液，每孔加入DPBS洗涤1‑2次，然后将步骤(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每个稀释梯度设多个重复样，加样顺序按照从低到高进行；同时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组；4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液，每孔加入洗涤DPBS1‑2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测；6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP：首先吸弃微孔板中的培养液，加入PBS洗涤；然后向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定，免摇动在室温条件下孵育；吸弃固定缓冲液，用透膜缓冲液洗脱细胞；吸弃透膜缓冲液，沿管壁向每孔加入封阻液，在摇床上缓慢上摇动室温下孵育；吸弃封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室温下缓慢摇动孵育；吸弃一抗，加入洗涤缓冲液，洗涤多次；吸弃洗涤缓冲液，沿管壁向每孔加入二抗，室温下避光缓慢摇动，孵育；加入洗涤缓冲液，室温下避光缓慢摇动，洗涤多次；洗脱结束之后，完全去除洗脱液；最后，洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光成像系统进行扫描，使用700nm和800nm两个通道同时扫描，以获取HTNV NP的红外荧光强度；7)计算HTNV中和抗体效价：获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度，然后计算每孔中HTNV NP红外荧光强度相对比NIR，NIR＝NP荧光值/内参蛋白荧光值；再利用Karber方法计算获得待测样本中和滴度，即中和抗体效价。