[发明专利]一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法

摘要

本发明公开一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：1)菌种划线培养；2)一级纯化培养；3)二级纯化培养；4)菌种保存；5)冻存菌种复苏；6)菌种一级培养；7)菌种二级培养；8)菌种三级培养；9)菌种四级发酵；10)发酵液离心；11)菌泥收集；12)冻干保护剂添加；13)冷冻干燥；14)冻干粉收集；15)粉碎、包装。该制备方法有效达到植物乳杆菌增殖培养、冻干粉活菌数量大、菌体收率高的目的。

主权项

1.一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)菌种划线培养：将植物乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；4)菌种保存：对二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于‑40～‑80℃低温冰箱内，得植物乳杆菌菌泥冻存管，备用；5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的植物乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；6)菌种一级培养：将复苏好的1～2ml菌泥混合液直接接种至装有基础培养基的三角瓶A中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中B，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为4.80～5.30，培养周期6～12小时，直至监测到菌液OD₆₀₀值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm；11)菌泥收集：离心结束后，收集转鼓内的菌泥；12)冻干保护剂添加，菌泥收集完毕后，按照菌泥：冻干保护剂＝1:1～2的质量体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、得到混合均匀的菌液；所述的冻干保护剂的配制，按照比例为：脱脂奶粉60.0～100.0g/L、麦芽糊精20.0～40.0g/L、海藻糖80.0～200.0g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、甘油8.0～12.0g/L、谷氨酸钠0.8～1.5g/L、抗坏血酸钠0.8～1.5g/L、余量为无菌水，对各组分进行称量、混、溶解，于115℃灭菌30min，待温度降至室温后，冷藏于‑4℃冰箱内备用；13)冷冻干燥：将混合均匀的菌粉，分装到冻干机托盘中，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，真空度0～1.0Pa，温度－25℃，持续冻干43～58小时；14)冻干粉收集；15)粉碎、包装：按质量要求进行粉碎后包装；所述的步骤6)、7)、8)中基础培养基，按照配方比例为：酵母蛋白胨8.0～15.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、硫酸镁0.1～0.6g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.60，于115℃下灭菌30min；所述的步骤9)中优化培养基，按照配方比例为：酵母蛋白胨13.0～18.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物8.0～12.0g/L、乙酸钠8.0～12.0g/L、硫酸镁0.1～0.2g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.60，115℃下灭菌30min。