[发明专利]一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法

摘要

本发明公开了一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法，该方法包括以下步骤：动物血压测量；大鼠外周血淋巴细胞悬液制备；外周血T淋巴细胞亚群和Cx40、Cx43的检测。本发明首次公开了硫化氢与T淋巴细胞上连接蛋白的关系，提示硫化氢通过影响免疫细胞间的缝隙连接通讯，调节炎症因子的释放，从而在改善高血压炎症所致的靶器官损伤中发挥了重要作用。

主权项

1.一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：分组：WKY组：正常Wistar京都、大鼠，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射与NaHS处理组等量生理盐水，持续8周；SHR组：自发性高血压大鼠，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射与NaHS处理组等量生理盐水，持续8周；NaHS处理组：自发性高血压大鼠，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射56μmol/kg体重的NaHS，持续8周；步骤1、动物血压测量使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测各组大鼠尾动脉收缩压；测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值；步骤2、大鼠外周血淋巴细胞悬液制备在大鼠麻醉状态下，采集各组大鼠腹主动脉外周血，置于10g/LEDTA真空采血管内；外周血进行离心，将血清和血细胞分离开，在血细胞中加至少一倍的PBS溶液，充分混匀，将稀释后的血细胞轻铺于等量淋巴细胞分离液上，1500r、30min，抽取云雾状于1.5ml离心管中，1800r、6min，弃上清，PBS溶液重悬，备用；步骤3、外周血T淋巴细胞亚群和Cx40、Cx43的检测取流式专用染色管，各组大鼠按照顺序分别标记为空白管、测定管和同型对照管，各管分别加入相应流式抗体，依据抗体说明书调整抗体终浓度，并设立阴性对照；室温避光孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测；标记CD4‑APC和CD8‑PE的管中加入固定剂120μL,4℃孵育30min，再用破膜buffer破膜，根据说明书参考浓度加入山羊抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的兔抗山羊IgG，FITC同型对照，和小鼠抗大鼠Cx43抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG，FITC同型对照，37℃孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测；将流式细胞仪调整至最佳工作状态，以FSC/SSC设门并排除死细胞和细胞碎片，根据同型对照调整好实验参数后再进行样本测定，首先设门于CD3+淋巴细胞，然后设门于CD4+和CD8+细胞，破膜后的淋巴细胞设门于CD4+和CD8+，然后设门于Cx40+、Cx43+细胞，所有样本均在2h内完成对细胞的检测，每管检测20000个细胞，计算机读出测定值，最后对收集的数据进行分析；步骤3中所述的相应流式抗体具体为：CD3‑FITC，FITC同型对照；CD4‑APC，APC同型对照；CD8‑PE，PE同型对照；山羊抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的兔抗山羊IgG，FITC同型对照；小鼠抗大鼠Cx43抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG，FITC同型对照。