[发明专利]一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法

摘要

本发明公开了一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，具体步骤如下步骤一，采集外周血液样本；步骤二，血细胞分离；步骤三，抗体染色；步骤四，细胞固定；步骤五，乙醇脱水；步骤六，探针孵育；步骤七，清洗；步骤八，封片。本发明可以对前列腺癌进行早期检测，从而帮助诊断及治疗；本发明可以特异性地检出循环血液系统中的游离肿瘤细胞，统计出阳性率，通过病人治疗疗程不同时间节点的阳性率和细胞数目情况指导医生选择治疗方案；本发明可以进行后续检测工作，如单细胞测序、靶向药物筛选等，可同时检测其它肿瘤标准物，更加全面检测肿瘤的转移、耐药以及分化等情况，使用效果好。

主权项

一种检测前列腺癌循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一，采集外周血液样本：取一只采血管，抽取前列腺癌患者的外周全血，如需寄送样品在常温放置并且在48小时内检测；步骤二，血细胞分离：将采血管配平后置于水平离心机中，离心机在常温下离心5‑8分钟，然后小心吸取上清至细胞层；向采血管中加细胞清洗液并且上下颠倒混匀，另取一只离心管并且加淋巴细胞分离介质，将混匀后的细胞小心转移到淋巴细胞分离介质上层，再加细胞清洗液，润洗后加在上层，重复润洗一次；将离心管放在离心机中，离心机在常温状态下离心4‑8分钟，离心后分为三层，底层红色的为红细胞，中间略带白色的中间层主要是白细胞和CTC，上层是黄色的血浆，吸取红细胞以上的全部液体，去除红细胞层；将磁珠混合均匀，逐滴加磁珠，水平摇床在常温下摇动15‑22分钟；取一只离心管，加淋巴分离介质，将含有磁珠的悬浮液转移至分离介质上层，将离心管放在离心机中，离心机在常温下离心5‑10分钟，再吸取底层分离介质及以上液体，用大磁力架吸附2‑3分钟；步骤三，抗体染色：抗体在抗体稀释液中配制，CD45‑Alexa 594抗体和PSMA‑Alexa 488抗体浓度均为1mg/ml，各自取CD45‑Alexa 594抗体和PSMA‑Alexa 488抗体1μl后加入抗体稀释液198μl，然后步骤二中的细胞中加200 μL 的稀释后抗体，避光常温孵育20 分钟，孵育后加细胞清洗液至14 mL, 离心机离心2‑5分钟，去除上清液至100 μl；步骤四，细胞固定：细胞与固定液按照1:1的比例混合，吹打混匀细胞，均匀涂在载玻片上的方框内，在28‑34摄氏度的烘箱中无风风干过夜；步骤五，乙醇脱水：将玻片插入100%乙醇脱色缸内1‑4分钟，擦去玻片背面和边缘的乙醇残留，用吹风机的冷风吹干；步骤六，探针孵育：加10ul的CEP8探针，盖上盖玻片并且在四周加封片胶封片，先在72‑80摄氏度下预杂交8‑12分钟；然后在35‑40摄氏度下杂交15‑18小时；步骤七，清洗：撕去封片胶，将玻片插入到装有探针杂交冲液液的染色缸内，在染色缸中晃动1‑2分钟，镊子平移推去盖玻片，在探针杂交缓冲液中清洗1‑2次，每次5分钟；然后在探针清洗液中清洗2‑4次，每次5分钟；步骤八，封片：采用封片剂进行封片，盖上盖玻片即可。