[发明专利]一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法

摘要

本发明公开了一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法，首先构建含有L‑谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K，并依此转化至毕赤酵母GS115中并进行抗性筛选；挑取转化子并利用甲醇进行诱导表达，热处理后通过离心‑硫酸铵沉淀‑离心‑复溶步骤，获得所需的成熟LGOX，本发明利用重组毕赤酵母同时分泌表达LGOX和蛋白酶K，快速获得成熟LGOX，从而降低LGOX的生产成本，以满足α‑酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。

主权项

一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有L‑谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K；(2)将重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K用限制性内切酶线性化后，将重组表达载体pPIC9K‑LGOX转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115‑LGOX；然后将pPICZα‑proteinase K转入到重组菌GS115‑LGOX中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得具有高效表达LGOX的重组菌GS115‑LGOX‑proteinase K；(3)重组菌GS115‑LGOX‑proteinase K使用诱导剂诱导表达重组蛋白，离心，收集上清液，经热处理，离心弃沉淀，上清液采用硫酸铵沉淀目的蛋白，离心，沉淀用缓冲液复溶，获得成熟LGOX。