[发明专利]一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法

摘要

本发明特别涉及一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法。包括：配制培养基；装罐；灭菌；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃‑124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温灭菌；接种；培养；取样对培养基中的多种酶进行测定。本发明原料选取方便，成本低，利用研究所得配方可以获得桑黄菌丝体及胞外活性物质的高产。菌丝体产量达到4.6217g/100mL。淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶在第7天达到酶活高峰；果胶酶在第6天达到酶活高峰；漆酶、愈创木酚酶在第2天达到酶活高峰；邻苯二酚氧化酶在第10天和15天分别产生一个酶活高峰。这些规律，对于工厂化液体培养时适时补充合适的营养成分具有较高的指导意义。

主权项

1.一种桑黄工厂化液体发酵过程中酶活规律的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）配制培养基： 培养基由以下重量的原料制成：麦麸6‑8%，玉米粉2‑4%，蛋白胨1‑3%，MgSO4·7H2O 0.05‑0.15%，KH2PO4 0.10‑0.15%，K2HPO4·3H2O0.02‑0.04%，其余为水，配制方法：麦麸放入足量的水中，煮沸45‑55min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O ，调pH值为6，配制6L培养基；（2）装罐：将培养基装入10L的发酵罐；（3）灭菌：在搅拌状态下，夹层蒸汽加热到105‑115℃；关闭搅拌，改为直接进蒸汽升温至119℃—124℃，压力0.1±0.05Mpa，保温灭菌；（4）接种：火焰圈保护接种，向灭菌后的培养基中接入处于迅速生长期的培养8d的桑黄液体菌种；（5）培养：T为28±0.5℃；罐压为0.05±0.005Mpa；空气流量：0‑92h，0.20m³/h,93‑358h,0.30m³/h，359‑422h，0.20m³/h阶段性调节；搅拌：0‑62h，20Hz，63‑160h，30Hz，161‑332h，20Hz，333‑422h，10Hz，取样分别对培养液的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚酶活性进行测定，测定方法如下：淀粉酶活性测定：可溶性淀粉溶液中加入粗酶液，32‑45℃水浴准确保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，通过紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；羧甲基纤维素酶活性测定：羧甲基纤维素钠溶液中加入粗酶液，42‑55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂，沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；半纤维素酶活性测定：小麦半纤维素溶液中加入粗酶液，42‑55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；果胶酶活性测定：在果胶溶液中加入粗酶液，42‑55℃水浴保温，取出后加入配制的DNS试剂,沸水浴加热，取出冷却后加入蒸馏水，混匀，紫外可见分光光度计测520nm处的OD值；漆酶活性测定：邻联甲苯胺溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，20‑35℃保温后，用紫外分光光度计于600nm处测光密度值；邻苯二酚氧化酶活性测定：邻苯二酚溶液、磷酸盐缓冲液、粗酶液混合得反应液，反应液20‑35℃保温后，用紫外分光光度计于400nm处测光密度值；愈创木酚酶活性测定：愈创木酚溶液、醋酸盐缓冲液和粗酶液混合得反应液，反应液20‑35℃保温后，用紫外分光光度计于490nm处测光密度值。