[发明专利]一种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法

摘要

本发明公开了一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法，包括以下步骤：1、取长度为60‑90cm小肠肠段，肠腔中灌注37℃预热充氧磷酸缓冲液100‑150mL，两端用止血钳夹住后，于37℃水浴振荡器中孵育30分钟，震荡速度为70转/分钟；2、弃磷酸盐缓冲液，灌注细胞分离液100‑150mL，继续于37℃水浴振荡器中分别孵育2.5小时，震荡速度为70转/分钟，分别于不同时间点收集细胞分离液并灌注新的细胞分离液；3、所收集细胞分离液于4℃、400g离心10分钟，所得沉淀即为肠上皮细胞，根据孵育时间由前至后收集的细胞依次为沿隐窝‑绒毛轴从绒毛顶端至隐窝底部不同部位细胞。本发明分离的细胞为体内研究小肠上皮细胞分化机制、营养吸收代谢和相关疾病药物开发提供了新的技术方法。

主权项

1.一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n（1） 向60-90cm仔猪小肠肠段的肠腔中灌注37℃预热充氧的磷酸缓冲液100-150mL，用止血钳夹住肠段两端后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育25—35分钟，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟；/n（2） 除去肠腔中的磷酸盐缓冲液，向肠腔中灌注细胞分离液100-150mL后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育2—3小时，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟，根据肠段部位在孵育的不同时间点收集细胞分离液并向肠腔中灌注新的细胞分离液；/n（3） 将收集的细胞分离液于4℃离心，所得沉淀即为肠上皮细胞；/n所述根据肠段部位在不同时间点收集细胞分离液是：肠段绒毛顶端分化成熟上皮细胞在孵育10-40分钟时收集细胞分离液、绒毛中部正在分化上皮细胞在孵育41-90分钟时收集细胞分离液、隐窝增殖上皮细胞在孵育91-150分钟时收集细胞分离液；绒毛上部上皮细胞在孵育20分钟和40分钟时收集细胞分离液；绒毛中部上皮细胞在孵育65分钟和90分钟时收集细胞分离液；隐窝上皮细胞在孵育120分钟和150分钟收集细胞分离液；/n所述磷酸盐缓冲液中各组分及浓度如下：氯化钠135-150mM、磷酸二氢钠4-6mM, 磷酸氢二钠4-6mM，苯甲基磺酰氟0.1-0.3mM，二硫苏糖醇0.4-0.6mM；/n所述细胞分离液中各组分及浓度如下：氯化钠115-125mM、氯化钾4.6-5.0mM、硫酸镁1.0-1.5mM、磷酸二氢钾1.0-1.5mM、碳酸氢钠20-30mM、4-羟乙基哌嗪乙磺酸8-12mM、D-葡萄糖1-4mM、谷氨酰胺1.0-5.0mM、谷氨酸0.5-2.5mM、乙二胺四乙酸二钠3.5-6.5mM、二硫苏糖醇0.4-0.6mM，牛血清白蛋白的重量百分比浓度为0.25%。/n