[发明专利]一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法有效
| 申请号： | 201611202242.4 | 申请日： | 2016-12-23 |
| 公开（公告）号： | CN106755410B | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 孙涛;刘潇 | 申请（专利权）人： | 孙涛 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 51214 成都九鼎天元知识产权代理有限公司 | 代理人： | 易小艺<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 610072 四川省成都*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | 本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，包括获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞（PBMC）的分离、利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头、PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤。通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得淋巴细胞中TCR（Alpha链或Beta链）和BCR（Heavy链或Light链）的基因序列的全长信息。 | ||
| 搜索关键词： | 高通量测序 淋巴细胞 分子生物学检测 淋巴细胞分离液 外周血单核细胞 检测T细胞 方法提取 基因序列 免疫组库 上游引物 下游引物 反转录 人血液 总RNA 抗凝 样本 | ||
【主权项】：
1.一种基于高通量测序同时检测T细胞(TCR)和B细胞(BCR)免疫组库的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；/n(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；/n(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT；/n(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；接头为XCR 5’ Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’；/n(5)PCR1:通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式扩增重组TCR和BCRcDNA；PCR 1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟，25循环；72℃1分钟；4℃永久；/n(6)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增,并利用磁珠进行DNA纯化；PCR 2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，18循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久；/n(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果。/n
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