[发明专利]一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒

摘要

本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法及引物组合物及试剂盒，获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞的分离、利用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD‑1分子的表达量、利用流式细胞仪分离CD8+T细胞、利用Trizol的方法提取CD8+T细胞的总RNA，所用试剂为RNAzol RT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤，通过从RNA 5’端接头的上游引物到T细胞受体基因（TCR）C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。

主权项

一种用于评估肿瘤免疫治疗效果的分子检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞的分离；(三)利用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD‑1分子的表达量；所用的抗体为：anti‑CD3、anti‑CD8、anti‑PD1和anti‑4‑1BB；(四)利用流式细胞仪分离CD8+T细胞；(五)利用Trizol的方法提取CD8+T细胞的总RNA，所用试剂为RNAzol RT；(六)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；(七)PCR1：通过单对引物的方式扩增重组TCR cDNA；(八)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增，并利用磁珠进行DNA纯化；(九)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；对比治疗前后的T细胞多态性和克隆性，来判断免疫系统的对免疫治疗的反应情况。