[发明专利]一种基于GST‑PullDown以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法（1）目的基因克隆以及原核表达载体构建；（2）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建；（3）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因进行原核表达；（4）对蛋白进行大量表达和破菌检测；（5）明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST‑Pull Down试验；（6）GST‑Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC‑MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。本发明能够较快的获得相关基因的互作蛋白；方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。

主权项

一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：(1)目的基因克隆以及原核表达载体构建根据如皋黄鸡目的基因的NCBI基因登陆号寻找目的基因的CDS全序列，设计特异性引物并引入EcoR I和Hind III酶切位点，酶切位点根据目的基因的基本信息进行确定，通过PCR方法克隆目的基因CDS全序列，克隆产物纯化后经测序验证，用于后续试验；(2)Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建将步骤(1)测序正确的克隆产物和Pet‑49(b)原核表达载体分别通过EcoR I和Hind III进行双酶切，酶切3h后进行纯化并连接，连接16h后转化DH5α，挑取阳性细菌克隆并提取质粒，通过双酶切和测序对构建的原核融合表达重组质粒进行鉴定，获取构建成功的Pet‑49(b)‑GST‑目的基因质粒；(3)Pet‑49(b)‑GST‑目的基因进行原核表达将步骤(2)获取构建成功的Pet‑49(b)‑GST‑目的基因质粒转化原核达菌种BL，同时利用异丙基硫代半乳糖苷IPTG对BL菌种进行诱导，诱导3h后提取菌液蛋白，通过SDS‑PAGE检测蛋白的表达情况，同时利用GST和目的基因基因抗体检测目的蛋白的表达情况；(4)对蛋白进行大量表达和破菌检测；(5)明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST‑Pull Down试验；(6)GST‑Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC‑MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。