[发明专利]紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法

摘要

本发明涉及一种紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法，是基于线粒体DNA序列的差异性而设计的标记引物mtDNA‑Z，分别由左端引物序列mtDNA‑Z‑F：5’‑TATGAGGTGTCCCCCAAGTC‑3’和右端引物序列mtDNA‑Z‑R:5’‑ACTGGCAGACAAACAAATCGT‑3’组成，以提取的紫扇贝、海湾扇贝与回交扇贝的DNA为模板，并利用该引物对其进行PCR扩增，若在近460bp处有PCR特异性条带出现，则确定母本线粒体基因来源为紫扇贝，若在近460bp处无PCR特异性条带出现，则确定其母本线粒体基因来源为海湾扇贝，本发明排除了核基因组DNA的影响，无需单独提取线粒体DNA来进行鉴定，因此可以快速高效的鉴定出紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代的亲本来源，方法简便，周期短，可大批量进行，为确保育种进程的顺利进行和确证回交后代的谱系提供技术支持和保障。

主权项

1.一种紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法，其特征是所用标记引物为mtDNA‑Z，其由左端引物序列mtDNA‑Z‑F和右端引物序列mtDNA‑Z‑R组成，其中左端引物序列mtDNA‑Z‑F为5’‑TATGAGGTGTCCCCCAAGTC‑3’，右端引物序列mtDNA‑Z‑R为5’‑ACTGGCAGACAAACAAATCGT‑3’ ；所述的紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法的具体步骤如下：（1）取待鉴定的紫扇贝、海湾扇贝与海紫紫回交扇贝、紫海海回交扇贝、紫海紫回交扇贝、海紫海回交扇贝的闭壳肌，直接用常规的方法提取全基因组DNA，用TE缓冲液稀释至终浓度100 ng/μL保存在‑20℃备用；其中所述海紫紫回交扇贝为海紫杂交扇贝卵子×紫扇贝精子的后代,且前述海紫杂交扇贝为海湾扇贝卵子×紫扇贝精子的后代;所述紫海海回交扇贝为紫海杂交扇贝卵子×海湾扇贝精子的后代,且前述紫海杂交扇贝为紫扇贝卵子×海湾扇贝精子的后代; 所述紫海紫回交扇贝为紫海杂交扇贝卵子×紫扇贝精子的后代,且前述紫海杂交扇贝为紫扇贝卵子×海湾扇贝精子的后代; 所述海紫海回交扇贝为海紫杂交扇贝卵子×海湾扇贝精子的后代,且前述海紫杂交扇贝为海湾扇贝卵子×紫扇贝精子的后代；（2）分别以提取的紫扇贝、海湾扇贝、上述回交扇贝的DNA为模板，用上述引物对其进行PCR扩增，反应体系为10µL，包括0.25 U Taq DNA 酶, 含1.5mM MgCl₂的1×PCR buffer, 0.2mM dNTP mix, 左右端引物各1μM, 50ngDNA模板；反应程序为：94℃预变性3min, 94℃ 1min, 56℃ 1min, 72℃ 1min, 30个循环，72℃延伸10min；PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察电泳结果；如果在近460bp处有PCR特异性条带出现，则确定母本来源为紫扇贝，如果在近460bp处没有PCR特异性条带出现，则确定其母本来源为海湾扇贝。