[发明专利]用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法

摘要

本发明公开了一种用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法，所述方法通过引物设计、引物修饰、PCR扩增、毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进行比对进行人源亲缘关系的鉴定。本发明所述方法采用的位点数量多，鉴定准确率高；采用两核苷酸重复的STR，比传统的四核苷酸重复STR突变率更低，增强了鉴定的可靠性；对扩增用引物进行了修饰使鉴定结果更加清晰明显；本发明所述方法可用于犯罪调查、亲子鉴定或人源细胞鉴定。

主权项

1.一种用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）引物设计 选择距离基因功能位点至少1百万碱基对的人类基因组上的30个STR位点，逐一参照所述STR位点两侧的序列设计并人工合成每个STR对应的小核苷酸序列作为引物，所述引物的退火温度为55‑65℃；所述引物见表1；（2）引物修饰 在正向引物5'端连接荧光染料FAM或HEX，以使不同片段带有不同荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“GTTTCTT”或“GTTTCT”碱基序列，以消除两碱基重复核苷酸STR电泳时产生的滑移峰；（3）扩增、电泳（a）各个对应多聚酶链式反应的条件：各对引物在扩增体系中的终浓度见表1；PCR反应条件为：95℃ 5 min，之后以95℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行10个循环，再以89℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行25个循环，最后72℃ 20 min，得到PCR产物；（b）将步骤（a）所得PCR产物进行PCR分组和毛细管电泳分组，所述PCR分组是根据实验测定，把不会相互干扰的引物归为一组，将引物分为PCR1、PCR2、……PCR9九个组，每一组放在一个孔里进行反应扩增；所述毛细管电泳分组以符合颜色或PCR片段大小其中至少有一项区别于组中其它STR进行分组，将所述PCR产物分为Panel1、Panel2、……Panel5五组，每一组放在一个泳道中进行毛细管电泳；进行毛细管电泳时所述PCR产物的最终稀释倍数为125倍；（4）鉴定 根据毛细管电泳检测所得结果，不同的等位基因在电泳检测图上显示为不同的峰，若不同两个人的生物样本在相同位点的分型结果相同，且30个微卫星均遵循此规则，即可判定二者有亲缘关系，可用于进行亲子鉴定；若不同两个样本同时在相同位点有两个峰，并且30个微卫星均遵循此规则，即可判定这两个样本来源于同一个体或细胞系；表1：STR、引物、引物修饰及引物终浓度。