[发明专利]人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法

摘要

本发明属生物医学研究与应用领域，涉及人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，本发明从人类多能干细胞定向分化形成心肌细胞后对人类心室肌细胞进行特异性筛选纯化及大量制备。本发明利用基因组编辑技术，构建MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞系，并定向诱导分化为心肌细胞，进而通过新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因纯化得到人类心室肌细胞，其可与任意支架材料结合培养形成性质不同的各种工程化人类心室肌组织。本发明的人类心室肌细胞具备与正常人类心室肌细胞相似的表型及电生理反应，来源广泛，且能长期体外培养。为针对心室肌损伤与疾病的治疗手段和筛选有效的药物提供了良好的平台。

主权项

1.人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，其特征在于，利用基因组编辑技术，编辑人类多能干细胞基因组，构建特定的MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞株，其包括步骤：A、构建针对靶基因MYL2的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒；B、构建带有步骤A所述靶基因的同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的供体质粒；C、培养良好的未分化的不同来源的人类多能干细胞，其中包括制备的人类胚胎干细胞与通过体外重编程正常人类个体的体细胞获得的人类诱导多能性干细胞人iPS细胞；D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒与步骤B获得的MYL2同源基因供体质粒共电转入人类多能干细胞，通过基因重组将MYL2同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记导入人类多能干细胞的基因组；E、通过基因测序与单克隆筛选获得成功同源重组的带有MYL2结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的人类多能干细胞，并建立相应细胞株；F、将步骤E所述获得的带有MYL2结合药物或荧光筛选标记的人类多能干细胞细胞株，通过人类多能干细胞定向分化心肌细胞技术，得到未经过筛选纯化的人类心肌细胞；G、将步骤F中未经筛选纯化的分化后的人类心肌细胞，通过新霉素药物筛选或绿色荧光蛋白流式细胞仪分选进行纯化；H、将步骤G中所述的经过新霉素或绿色荧光蛋白筛选的人类心室肌细胞进行验证，得具有正常人类心室肌细胞的相应表型。