[发明专利]乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶及其制备和使用

摘要

在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的乙烯基异构酶‑脱水酶，包括烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和巴豆醇脱水酶。在一些替代实施方案中，提供了非天然或经遗传改造的多肽，其具有包含例如乙烯基异构酶‑脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶活性，或者其组合的活性。在一些替代实施方案中，还提供了编码本文所述多肽的非天然或经遗传改造核酸(多核苷酸)、其中包含或已包含本文所述核酸的表达或克隆载体，以及其中包含或已包含本文所述核酸的非天然或经遗传改造细胞。在一些替代实施方案中，还提供了制备不同有机化合物(包括甲基乙烯基甲醇和丁二烯)的方法。

主权项

1.一种分离的、合成的、或重组的核酸(多核苷酸)，其包含：(a)(i)与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101组成的核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，或者其互补序列，条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的多肽，或者(ii)与由SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101组成的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，或者其互补序列；(b)在严格条件下与包括SEQ ID NO:11、13、14、21、36、42、48、54、60、63、65、71、73、79、85、91或97或者SEQ ID NO:15、17、18、40、46、52、58、69、77、83、89、95或101的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约65℃的温度下在0.2X SSC中洗涤约15分钟，或者其互补序列，条件是所述核酸序列不编码含或不含信号肽的“LDRV”或“cdLD-Botes”蛋白或多肽或者含或不含信号肽的具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示序列的蛋白质；(c)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，或者该编码核酸的互补序列；(d)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(a)至(c)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；(e)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：V19A、L21L、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S和L368F(参照SEQ ID NO:12编号)或在通过与SEQ ID NO:12比对鉴定的对应位置的相同替换；(f)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(e)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；(g)编码具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102所示序列的多肽或其酶活性片段的核酸，所述多肽或其酶活性片段具有选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替换：如见于“LDRV”中相对于SEQ ID NO:2作出的氨基酸替换(参照SEQ ID NO:2编号)或在通过与SEQ ID NO:2比对鉴定的对应位置的相同替换；(h)编码具有至少一个保守氨基酸替换的多肽的(g)的核酸，或者该编码核酸的互补序列；或者(i)以下核酸：(1)其编码能够产生与具有SEQ ID NO:12、22、37、43、49、55、61、62、64、66、72、74、80、86、92或98或者SEQ ID NO:16、41、47、53、59、70、78、84、90、96或102的序列的多肽特异性结合的抗体的多肽，或者(2)(1)中核酸的互补序列；其中(a)至(i)中任一个的核酸编码的多肽：(1)具有芳樟醇脱水酶-异构酶(LinD)活性，(2)具有乙烯基异构酶活性，(3)具有脱水酶活性，任选地烯醇脱水酶活性，(4)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇，(5)能够酶促催化3-丁烯-2-醇转化为丁二烯或1,3丁二烯，(6)能够酶促催化巴豆醇(丁-2-烯-1-醇)转化为丁二烯或1,3丁二烯，(7)能够酶促催化2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇转化为二甲基-丁二烯，(8)催化对应于通式CnH2nO的化合物转化为CnH2n-2+H2O，其中3<n<7，其中任选地对应于其中3<n<7的通式CnH2nO的化合物是巴豆醇、丁-3-烯-2-醇或丁-3-烯-1-醇，和/或对应于其中3<n<7的通式CnH2n-2的化合物是1,3丁二烯，并且任选地对应于其中3<n<7的通式CnH2nO的化合物是2,3-二甲基-丁-2-烯-1-醇、2,3-二甲基-丁-3-烯-2-醇或2,3-二甲基-丁-3-烯-1-醇，和/或对应于其中3<n<7的通式CnH2n-2的化合物是二甲基丁二烯，或者(9)(1)至(8)的任意组合。