[发明专利]靶核酸的定量方法和用于该方法的试剂盒

摘要

本发明的目的在于提供不实施连接反应、并且消除由PCR扩增效率引起的问题、兼顾靶核酸的测序和靶核酸的定量的方法。上述目的通过下述方法得以解决：(1)使用导入有对靶核酸的序列具有特异性的序列并且在其上游导入有随机序列和已知序列的引物，实施单引物延伸反应，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸；(2)以所得到的双链核酸作为模板，使用对已知序列具有特异性的引物和具有靶核酸的序列的一部分的引物实施PCR，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸的扩增物；(3)使用所得到的双链核酸的扩增物，进行测序，将随机序列与靶核酸的序列一同进行解读。

主权项

1.一种靶核酸的定量方法，包括下述步骤(1)～(4)：(1)以作为靶核酸的沿着从3’末端侧向5’末端侧的方向包含第一序列、对象序列和第二序列的单链核酸或由作为靶核酸的双链核酸得到的该单链核酸作为模板，使用沿着从5’末端侧向3’末端侧的方向包含特定序列、随机序列和与第一序列互补的序列且与随机序列的种类的数量对应的多个种类的第一引物，实施退火反应、核酸延伸反应和核酸酶反应，由此得到一条单链沿着从5’末端侧向3’末端侧的方向包含特定序列、随机序列、与第一序列互补的序列、与对象序列互补的序列和与第二序列互补的序列的第一双链核酸的步骤；(2)以步骤(1)中得到的第一双链核酸作为模板，使用包含第二序列的第二引物和包含特定序列的第三引物，实施PCR，得到第二双链核酸的步骤；(3)确定步骤(2)中得到的第二双链核酸的序列的步骤；(4)基于步骤(3)中确定的序列，测定对象序列和随机序列的组合的数量，由此，利用下述数学式(1)对靶核酸进行定量的步骤，式中，N表示靶核酸的数量，C表示随机序列的种类的数量，H表示测定得到的对象序列和随机序列的组合的数量。