[发明专利]基于人RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系及其构建方法

摘要

本发明公开了一种基于人RNA聚合酶I(hPolI)系统的肠道病毒68型(EV‑D68)微复制子的构建及应用。本发明所提供微复制子是将野生型EV‑D68基因组RNA中的编码区替换为萤火虫荧光素酶(firefly‑Luciferase，f‑Luc)报告基因得到带有EV‑D68基因组全部非编码区(UTR)基因和报告基因的质粒，即EV‑D68微复制子。由于微复制子不产生具有感染性的活病毒，因此可以在普通实验室进行EV‑D68的复制调控机制研究。该微复制子不同于传统正股RNA病毒微复制子，无需体外转录，避免了RNA操作，大大简化了实验过程。利用该微复制子，EV‑D68的非编码区功能可以用报告基因检测试剂盒定性定量检测，为肠道病毒68型的病毒UTR区在致病机制和病毒复制过程中的作用机制研究以及疫苗、药物的研发提供了一个简单、快速、灵敏、安全的研究平台。

主权项

1.一种基于RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型微复制子体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)公司合成EV‑D68 Fermon病毒株的5’UTR cDNA；所述Fermon的5’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为引物，PCR扩增得到肠道病毒68型毒株Fermon的5’UTR片段；(3)以实验室保存pcDNA3.1‑f‑Luc质粒为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物，PCR扩增得到f‑Luc片段；(4)以步骤(2)得到的PCR产物和步骤(3)得到的PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7为引物进行overlapping‑PCR扩增；回收混合PCR产物；(5)以步骤(4)得到的PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8为引物进行PCR扩增；(6)Pst1和Not1双酶切经步骤(5)得到的PCR产物和VR1012载体，连接，筛选阳性克隆；(7)以步骤(6)得到的阳性克隆为模板，以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增，PCR产物经DpnI酶37℃处理30分钟，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选获得无BsmB1酶切位点的f‑Luc微复制子片段；(8)以步骤(7)得到的处理后的质粒为模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12为引物，PCR扩增得到带有BsmB1酶切位点的f‑Luc微复制子片段；(9)BsmB1酶切步骤(8)得到的PCR产物和pHH21载体，连接，筛选阳性克隆，即为RNA聚合酶I系统的肠道病毒68型f‑Luc微复制子；(10)以步骤(9)得到的pHH21‑EV‑D68‑f‑Luc为模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物，PCR扩增，PCR产物经DpnI酶37℃处理30分钟，转化感受态大肠杆菌DH5α，得到5’UTR 108‑207碱基缺失的EV‑D68微复制子突变体：pHH21‑EV‑D68_Δ180‑207‑f‑Luc。