[发明专利]液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法

摘要

本发明公开了液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，具体程序是先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子·子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量。

主权项

1.液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，其特征在于，所述14种环境荷尔蒙分别为：邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A、三氯沙；采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，具体程序是先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子‑子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量；其中，色谱柱1和色谱柱2并联设置，通过流动相A1、B1与色谱柱1实现邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯这9种组分的定量分析，分析结束后切换至流动相A2、B2与色谱柱2实现壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙这5种组分定量分析；具体色谱条件为：(1)高效液相色谱条件：色谱柱1：Kinetex XB‑C18 100mm*2.1mm*2.6uM；流动相：A1，含0.1％v/v甲酸的水溶液；流动相：B1，乙腈；洗脱梯度如下：柱温：35℃；流速：0.4mL/min；进样量：20μL；色谱柱2：BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM；流动相：A2，含0.1％v/v氨水的水溶液；流动相：B2，甲醇；洗脱梯度如下：柱温：50℃；流速：0.2mL/min；进样量：20μL；(2)质谱条件：离子源：电喷雾Turbo Spray，负离子扫描；离子源温度550.00℃；扫描方式：多反应监测；碰撞气5.00Psi；气帘气40.00Psi；雾化气55.00Psi；辅助气55.00Psi；电喷雾电压‑4500.00V；采集离子对如下：其中，所述的经过预净化处理的尿液样本按如下方法制备得到：准备200uL尿液样本，向其中加入10μL β‑葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标液，在37℃水浴锅中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液，充分涡旋均匀，待SPE上样净化即得；甲酸和甲醇的混合水溶液中，甲酸、甲醇和水的体积比为5∶10∶85；β‑葡萄糖甘酸酶，其酶活100000units/mL以上；所述的SPE上样净化，过程如下：依次用1ml甲醇、1ml水进行活化SPE小柱；上样，移取预处理过的尿液样本或内标品300uL进行上样，自然滴落，流出液弃去；淋洗，依次用1ml水、1ml 10％v/v甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗液弃去，以真空泵抽干柱子约1min至近干；洗脱，1ml甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液氮吹至近干，用100μL含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液复溶；所述的含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液，甲醇和水体积比是1∶1。