[发明专利]一种双层组织工程皮肤及其制备方法

摘要

本发明公开一种组织工程双层皮肤及其制备方法，组织工程双层皮肤是以成纤维细胞和表皮细胞作为种子细胞，以脱细胞羊膜作为生物支架，构建获得的组织工程双层皮肤，本发明的组织工程双层皮肤具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点，是一种移植效率高的皮肤替代物。本发明还提供一种组织工程双层皮肤的制备方法。

主权项

1.一种组织工程双层皮肤的制备方法，其特征在于，包括下列步骤： a、准备脱细胞羊膜、培养液和多能干细胞1）准备脱细胞羊膜1‑1）选取已经脱离人体的胎盘，用无菌PBS冲洗，自羊膜与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离羊膜，前述取材均在无菌条件下完成；1‑2）羊膜的脱脂处理：浸泡于氯仿和乙醇的混合液30min，其中，氯仿和乙醇的体积比为1:1；1‑3）羊膜的去污处理：浸泡于稀释的Triton X‑100中，常温去污处理5‑7h；1‑4）羊膜的脱细胞处理：用0.02% EDTA，在37℃下处理2 h，然后用细胞刮片在显微镜下刮去上皮细胞；1‑5）羊膜的灭菌处理：将羊膜放入含有抗菌药的PBS液浸20‑30min；1‑6）羊膜的保存处理：用无纺布作为羊膜的贴载物，‑80℃保存于无菌甘油和DMEM的混和液中，混和液中无菌甘油和DMEM的体积比为1：1；1‑7）羊膜在使用前浸泡在无菌生理盐水10‑20min，使无纺布与羊膜分离开，之后羊膜用无菌PBS洗干净至无甘油，得到脱细胞羊膜备用；2）准备培养液2‑1）配制培养液A：REGM培养基与MEF培养基以体积比为1：1的比例混合；2‑2）配制培养液B：mTesR1培养基；2‑3）配制500 mL培养液C：1‑5 mmol/L L‑谷酰胺、50‑100 ug/L bFGF、8‑10 mol/L地塞米松、DMEM基础培养基、FBS，其中DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2‑4）配制500 mL培养液D：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、10‑50ng/mL hEGF、1‑6ng/mL HGF、1‑4ng/mL bFGF、1‑10ng/mL PDGF、 1‑10ng/mL IGF、2‑10 ng/mL TGF‑β、DMEM/F12培养基、FBS，其中DMEM/F12培养基与FBS的体积比为9:1；2‑5）配制500 mL培养液E：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、10‑40ug/L KGF、20‑80 ug/L TGF‑β、6‑15ug/L PDGF‑AB、10‑25 ug/L VEGF、1‑7ug/L IL‑2、0.1‑0.75 ug/mL氢化可的松、MEM基础培养基、FBS，其中MEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2‑6）配制500 mL培养液F：450mL商品用DMEM/F12培养基、50mLFBS、0.1‑1ng/mL氢化可的松、1×10^‑10mol/L霍乱毒素、0.01‑0.1ng/mL胰岛素、1×10^‑7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10^‑4mol/L腺嘌呤、100IU/m L青霉素、10‑25ng/m L hEGF、5‑15 ug/m L转铁蛋白、1‑10ug/m L谷氨酸、1‑7μM Y‑27632、0.01‑0.5mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2‑7）配制500 mL培养液G：5‑15ug/L bFGF、0.05‑2mmol/L Vc、0.01‑0.05 mmol/mL非必需氨基酸、DMEM基础培养基、FBS，其中，DMEM基础培养基、FBS的体积比为9:1；2‑8）配制500 mL培养液H：1‑5ng/mL胰岛素、0.1‑0.5ug/mL氢化可的松、10‑50 ug/mL腺嘌呤、100‑150 ug/mL Vc、1‑10ng/mL hEGF、2‑16ng/mL bFGF、10‑45ug/mL BPE、1‑25ug/mL转铁蛋白、0.1‑1mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2‑9）配制500 mL培养液I：0.01‑1μmol/L胰岛素、0.01‑1 mmol/mL非必需氨基酸、2‑20 ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、15‑50 ug/mL BPE、100‑500μg/mL氯化钙、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；3）准备多能干细胞3‑1）收集尿液细胞在每个收集杯加2mL混有青霉素和链霉素的双抗，每个收集杯中收集一份尿液；为每份尿液准备六孔板中的一个孔，将该孔用质量浓度为0.1%明胶包被20 min以上，使用前吸去孔内液体，得到包被孔；把尿液倒入离心管里，离心400g，10min；吸去上清液，每管留下1‑5mL的余量，然后将每管中的余量混合到一个总离心管内；向该总离心管加入10‑30mL PBS，轻轻混匀；然后离心400g，10min；再吸去上清液，剩余0.5‑1mL液体；把剩余的液体加入包被孔中，再加入3mL REGM、3µL Primocin；再将六孔板放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS清洗，再进行换液处理；当尿液细胞中融合细胞的体积达到总细胞体积的80%，进行传代培养；3‑2）尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞将表达转录调控因子 OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28中的一种或两种以上导入尿液细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的六孔板中，用培养液A培养补至2mL；转染后第2天，将培养液更换为2mL培养液B，每天更换新鲜培养液B，使尿液细胞克隆继续增殖；转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，加1mL培养液B培养获得诱导多能干细胞，将生长稳定的诱导多能干细胞进行传代培养得到多能干细胞；b、间充质干细胞的诱导培养1）弃除原有培养液B，向传代培养得到的多能干细胞中加DMEM/F12培养液清洗；2）弃除DMEM/F12培养液，加入DPBS消化5min，所述DPBS中含有0.5mM EDTA；3）然后离心400g，5min，再收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；4）待多能干细胞的面积长至六孔板面积的70%‑80%时，用PBS冲洗后，更换间充质干细胞诱导培养液C，每两天更换一次培养液；5）培养1‑3d，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，间充质干细胞培养液D重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至0.1%明胶预先包被的10cm 细胞培养皿中，当细胞达到90%融合后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化细胞并按照1：3的比例进行细胞传代，得到传代的间充质干细胞；c、表皮细胞的诱导培养1）弃除原有培养液D，向传代的间充质干细胞中加DMEM/F12培养液清洗；2）弃除DMEM/F12培养液，加含0.5mM EDTA的DPBS，消化5min；3）然后离心400g，5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；4）待间充质干细胞长至六孔板的70%‑80%时，PBS冲洗一遍后，更换表皮细胞诱导培养液E，每两天更换一次培养液E；5）培养3‑5d，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，表皮细胞培养液F重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，接种至10cm 细胞培养皿中，细胞生长的面积达到细胞培养皿面积的90%后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，培养液F重悬细胞，制成1×10⁶单细胞悬液，得到表皮细胞备用；d、成纤维细胞的诱导培养1）弃除原有培养液D，加DMEM/F12培养液清洗一遍；2）弃除DMEM/F12培养液，加含0.5mM EDTA的DPBS，消化5min；3）然后离心400g，5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；4）将间充质干细胞诱导培养液C更换成培养液G，每两天更换一次培养液G；5）培养4‑6d，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，得到成纤维细胞培养液H重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至细胞培养皿中，细胞生长的面积达到整个细胞培养皿面积的90%后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，培养液H重悬细胞，制成5×10⁵单细胞悬液，得到成纤维细胞备用；e、组织工程双层皮肤的培养1）将羊膜用打孔器在无菌的环境下，打成与培养板孔直径相同的羊膜圆片；2）将成纤维细胞接种到六孔板中的一个孔中，接种量为5×10⁵，补加500µL培养液H，用羊膜圆片朝下平铺于成纤维细胞上，固定住羊膜圆片，加入2mL培养液H进行培养；3）培养3d后，将成纤维细胞浸入到羊膜圆片中，每天更换一次培养液H，得到组织工程皮肤真皮层；4）接着吸弃培养液，然后将表皮细胞以1×10⁶的接种量，接种于羊膜圆片的上皮面，补加培养液F至2mL，移动培养皿使表皮细胞能均匀分散，置于细胞培养箱中培养；5）培养2d后表皮细胞紧贴于羊膜上皮面，将培养液弃去，加入2mL培养液I继续培养，培养3d，每天更换培养液I，完成制备，得到组织工程双层皮肤。