[发明专利]一种以牛大力花药为外植体的再生方法

摘要

本发明属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为外植体的再生方法，是以牛大力花药为材料经愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖，将增殖后的胚性愈伤组织诱导形成胚状体，再由胚状体诱导发育形成小植株，最后将小植株进行壮苗培养形成正常植株。本发明以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的再生体系，并创建了子叶型胚的二次诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业化发展提供技术支持。

主权项

1.一种以牛大力花药为外植体的再生方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、外植体获取在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后取花药；或75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药；或直接依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药；2)、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导将获取的牛大力花药接种在愈伤组织培养基上，培养温度24～26℃，暗培养；培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织；所述愈伤组织培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4‑D 3.5mg/L以下、6‑BA 0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；3)、胚性愈伤组织增殖诱导将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m‑2·s‑1；培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；将子叶型胚切成2╳2～5mm的小块，接入增殖培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m‑2·s‑1；培养40天后，可分化出胚性愈伤组织；所述子叶胚诱导培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6‑BA 2mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L、10％椰子水，pH5.8；所述增殖培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4‑D 2.0mg/L、BA 0.5mg/L、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、10％椰子水、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH5.8；4)、胚状体的诱导将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m‑2·s‑1；培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育胚状体；所述胚诱导培养基以改良的MS为基本培养基，添加6‑BA 1.0mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；5)、胚状体发育诱导及壮苗培养将诱导出的胚状体单个剥离并转接到胚发育培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m‑2·s‑1；培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株；将发育成的小植株转接到壮苗培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m‑2·s‑1；培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2‑3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗；所述胚发育培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6‑BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.01～0.15mg/L、10％CW、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8；所述壮苗培养基是以改良MS为基本培养基，并添加NAA 0.1～0.5mg/L、IBA 0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8；上述改良的MS培养基是在MS培养基的基础上，在其它成分和含量不变的条件下将肌醇浓度调整为200mg/L。