[发明专利]柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法

摘要

本发明公开了一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法包括步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、以引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R，Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列；B、回收PCR片段；C、将回收产物分别与载体pEASY‑T1vector连接；D、连接产物分别转化大肠杆菌；E、提取阳性克隆质粒；F、双酶切上/下游T‑载体重组质粒、pK18mobSacB；G、酶切后产物连接，连接液转化DH5α大肠杆菌；(3)将重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌；(4)蔗糖培养基法筛选突变体。

主权项

一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R、Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R的序列为：Hfq‑up‑F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，Hfq‑up‑R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，Hfq‑down‑F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，Hfq‑down‑R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY‑T1vector连接，得到上游T‑载体连接产物和下游T‑载体连接产物；D、将步骤C得到的上游/下游T‑载体连接产物分别转化大肠杆菌；E、提取步骤D中的阳性克隆的质粒，分别得到上游T‑载体重组质粒和下游T‑载体重组质粒；F、用BamHI和KpnI双酶切上游T‑载体重组质粒，用KpnI和XbaI双酶切下游T‑载体重组质粒，用BamHI和XbaI双酶切质粒pK18mobSacB；G、将步骤F得到的上/下游T‑载体重组质粒与质粒pK18mobSacB酶切后产物进行连接，将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态，保存经筛选获得的阳性克隆即缺失hfq基因的重组自杀质粒载体；(3)将步骤G构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞，挑取转化后经Kan+无糖NA筛选的单菌落；(4)将步骤(3)挑取的单菌落用蔗糖培养基筛选,即得突变体。