[发明专利]一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用

摘要

本发明提供一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用，本发明通过基因工程的方法对地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ptb基因进行敲除，得到地衣芽胞杆菌DW2△ptb，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中异丁酸和异戊酸合成量分别降低33%、37%，异味显著减少。

主权项

一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：1）根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列，设计ptb基因的上、下游同源臂引物；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂，再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；2）采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；同时，采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对质粒T2（2）‑ori进行双酶切，得到酶切质粒T2（2）‑ori，并将酶切基因序列A连接到酶切质粒T2（2）‑ori中，得到ptb基因敲除质粒T2（2）‑ori‑ ptb；3）通过电转化将步骤2）得到的ptb基因敲除质粒T2（2）‑ori‑ ptb转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ptb基因的上游臂或ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；4）挑选ptb基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌DW2△ptb（简称：Bacillus licheniformis DW2△ptb）；其中，步骤（1）和步骤（3）中所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ptb基因为SEQUENCE LISTING中所示。