[发明专利]一种表达多肽PA1B的方法

摘要

本发明提供了一种高效表达多肽PA1b的方法，包括如下步骤：(1)目的基因PA1b的合成；(2)PA1b基因和载体的连接；(3)重组质粒PUSCN1‑PA1b的转化；(4)重组质粒的酶切、测序鉴定；(5)293F(人胚肾悬浮细胞)细胞的转染；本发明的主要发明要点在于首次采用人源哺乳动物细胞成功表达PA1b，表达的蛋白质量稳定，产品均一，纯度达到98％，并且本发明多肽PA1b蛋白能够应用于制造治疗糖尿病的药物和食品中，其制作成本比胰岛素低，并且比胰岛素方便，可发展为口服型，无毒副作用，在血糖水平低于生理水平是不发挥降血糖作用。

主权项

一种高效表达多肽PA1b的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，设计上下游引物；并以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行PCR扩增获得PA1b目的基因片段；(2)PA1b基因和载体的连接：将目的基因片段PA1b和载体PUSCN1分别用限制性内切酶BamHI和XhoI酶进行双酶切，然后通过T4连接酶将酶切后的基因片段PA1b和载体PUSCN1进行连接获得重组质粒PUSCN1‑PA1b；(3)重组质粒PUSCN1‑PA1b的转化：将步骤(2)获得的重组质粒PUSCN1‑PA1b采用热激转化的方式导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒PUSCN1‑PA1b；(4)重组质粒的酶切、测序鉴定：将提取的重组质粒用BamHI和XhoI酶切，37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；酶切结果正确，将质粒送往测序机构进行鉴定以确定已连接的片段为所需的目的片段；(5)293F(人胚肾悬浮细胞)细胞的转染：在步骤(4)的鉴定结果通过后，将所述重组质粒PUSCN1‑PA1b导入到293F(人胚肾悬浮细胞)细胞进行转染，转染结束后，细胞继续培养7天，之后6000RPM离心10min并收取上清，镍离子柱亲和纯化PA1b蛋白，其纯度达到98％，经鉴定即为多肽PA1b。