[发明专利]基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用

摘要

本发明公开了一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用；根据RACE方法得到VTGAb全长序列；梯度雌激素注射金钱鱼后采样提取肝脏RNA；RT实时定量PCR法检测VTGAb的表达，并以EF1‑a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体后采样提取肝脏RNA，检测VTGAb的表达量，与检测体系进行对比，进而分析水样的环境雌激素污染程度。本发明能够在经济损耗较小的情况下测得环境激素的污染情况，并且控制金钱鱼单一变量，可用于海水，河流入海口和盐水内湖水样的环境雌激素污染程度。

主权项

一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到VTGAb全长氨基酸序列；S2、根据克隆得到的VTGAb全长的菌液提取质粒，根据片段长度和质粒浓度计算拷贝数后视为原液，将原液梯度稀释后使用VTGAb和EF1‑a荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR后得到曲线图；S3、选择未性成熟的金钱鱼，进行梯度雌激素注射，在不同时间点采样提取肝脏RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转cDNA；S4、以步骤S2获得的曲线图作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGAb的表达，并以EF1‑a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；S5、将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体中48～72h时(采样提取肝脏RNA，反转为cDNA，根据步骤S4的方法以EF1‑a为内参基因对待测样品进行荧光定量PCR检测VTGAb的表达量并分析VTGAb的表达水平，所得结果与步骤S4的检测体系对比，得出雌激素的污染浓度区间，进而分析水样的环境雌激素污染程度。