[发明专利]一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶；（2）配制纯丝素蛋白溶液；（3）采用W/O/O复乳法制备微球；（4）交联固化成球；（5）除油洗涤；（6）还原脱色；（7）洗涤。本发明还提供应用该方法制备得到的细胞培养用SFL微载体及其应用。本发明原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，得到的微载体表面呈多孔，比表面积大、生物相容性好、适合多种细胞培养使用。整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，具有广阔的市场前景。

主权项

一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na2CO3溶液中进行脱胶，获得丝素蛋白纤维，再用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干；（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl2/H2O/CH3CH2OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl2，Ca（NO3）2或H3PO4；（3）采用W/O/O复乳法制备微球：在搅拌状态下，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球；所述油相1选自真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween‑80中的一种或几种混合；所述油相2选自液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween‑80中的一种或几种混合；所述水相：油相1：油相2的体积比为1：1‑20:1‑20；搅拌转速为200‑1000rpm；（4）交联固化成球：向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂进行交联，获得微球；所述交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，先后用表面活性剂和去离子水反复洗涤步骤（4）获得的微球，抽滤得到丝素蛋白微球；所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、TRITON‑100、OP‑10、SA‑2两性表面活性剂、Tween‑20、Tween‑40、Tween‑60、Tween‑80中的一种或几种混合；所述表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1‑10%；（6）还原脱色：用还原剂中和多余的交联剂；所述还原剂为硼还原剂或甘氨酸；（7）洗涤：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，洗涤后筛分选择粒径为100‑400μm的微载体，得到细胞培养用SFL微载体。