[发明专利]一种基于单核苷酸多态性标记的桑树遗传分型方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单核苷酸多态性标记的桑树遗传分型方法。本发明根据高通量转录组测序筛选得到目的基因，通过PCR反应及PCR产物测序得到多个单核苷酸多态性位点。再由所有有效的单核苷酸多态性位点组成单倍体型用于分子标记以达到遗传分型。本发明操作简单、通量灵活、单核苷酸多态性标记遗传稳定可靠，可在生物学、遗传学研究中推广应用，为考证桑类中药原植物提供有力技术支持。

主权项

一种基于单核苷酸多态性标记的桑树遗传分型方法，其特征是由以下步骤构成：(1)种群调查与取样；(2)DNA提取；(3)高通量转录组测序，其中，高通量转录组测序的方法为：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，通过反转录反应合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度为500bp，在Illumina HiSeq2500测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列；(4)筛选种群的目标基因TR2222；(5)根据目标基因TR2222设计引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；(6)PCR扩增，其中，PCR扩增体系为50μl：36.5μl ddH2O、5μl 10×Buffer(含Mg2+)、4μl dNTP Mixture(2.5mM each)、0.5μl TaKaRa Taq(5U/μl)、2μl Template DNA(20‑40ng/μl)、1μl正向引物、1μl反向引物；PCR反应参数为：94℃预变性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环，72℃延伸10min；(7)将(6)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段，对回收产物进行测序；(8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点；其中，所述目标基因TR2222在桑树种群中有8个单核苷酸多态性位点，目标基因TR2222基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8个单核苷酸位点分别位于13、115、201、297、384、386、486、551。