[发明专利]抵抗饮食诱导肥胖的CTRP6干扰方法

摘要

本发明公开了一种抵抗饮食诱导肥胖的CTRP6干扰方法，包括以下步骤(1)重组慢病毒干扰载体的构建；(2)CTRP6干扰慢病毒的包装；(3)CTRP6干扰慢病毒的滴度测定；(4)pLentiH1‑CTRP6‑shRNA慢病毒侵染小鼠脂肪细胞效果；(5)pLentiH1‑CTRP6‑shRNA对小鼠组织中CTRP6表达的影响。本发明所述的抵抗饮食诱导肥胖的CTRP6干扰方法通过pLentiH1‑CTRP6‑shRNA慢病毒能显著降低脂肪组织中CTRP6 mRNA的表达水平，且脂肪组织中CTRP6的蛋白水平也明显下降，实现对小鼠组织和血清中CTRP6的干扰作用。

主权项

一种抵抗饮食诱导肥胖的CTRP6干扰方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组慢病毒干扰载体的构建：根据小鼠的CTRP6基因序列，设计3对小鼠CTRP6基因shRNA和无关序列的单链寡核苷酸，分别为CTRP6‑shRNA1、CTRP6‑shRNA2、CTRP6‑shRNA3、scramble，经退火后形成双链DNA，并与经BamH I和Xho I双酶切后的pLenti‑H1载体连接，产物转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆扩繁并提取质粒，将酶切鉴定成功的质粒进行测序，确保插入载体的序列与设计合成的靶基因链完全一致；(2)CTRP6干扰慢病毒的包装：转染前24h以2×104个/cm2密度将293T细胞接种于10cm皿中，待细胞密度大约80％～90％时进行转染，转染前2～4h更换8mL新鲜培养基，转染时，需要配置A、B两种液体，A液为将△8.9、VSV‑G和pLenti H1‑shRNA重组质粒按比例7.5：5：10溶解在1.5ml的Opti‑MEM培养基中，B液为将40μl脂质体溶解在1.5ml的Opti‑MEM培养基中，将A液和B液混合、震荡，室温静置20min，然后滴加到细胞培养皿中，6‑8h后更换新鲜培养基，在荧光显微镜下观察GFP表达情况，当293T细胞中出现GFP时证明重组慢病毒包装成功，然后收集病毒；(3)CTRP6干扰慢病毒的滴度测定：将收集后的病毒在3000r/min的条件下离心10min，去除细胞碎片，0.45μm滤膜过滤备用，取对数生长期的293T细胞，胰酶消化，接种于96孔板，以无血清培养基按照10×倍比稀释病毒，以10‑2‑10‑6浓度梯度分别感染包装细胞，每个梯度3个重复，每孔加入等体积的待测样品，37℃、5％CO2培养箱培养，2d后观察荧光表达情况，每孔计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度(pfu/mL)＝GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数/0.01mL，计算病毒滴度，确保其滴度达到107pfu/ml；(4)pLentiH1‑CTRP6‑shRNA慢病毒侵染小鼠脂肪细胞效果：用pLentiH1‑CTRP6‑shRNA慢病毒分别侵染小鼠脂肪细胞，48h后在荧光显微镜下观察，当细胞中都有较多的GFP表达时，说明病毒侵染效率较高，收集脂肪细胞的RNA和培养基，利用Realtime‑PCR检测CTRP6‑shRNA的干扰效率，结果表明，与scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中CTRP6‑shRNA2干扰效率最高，CTRP6‑shRNA1、CTRP6‑shRNA2、CTRP6‑shRNA3的mRNA干扰效率分别是50％、65％和45％左右，所以CTRP6‑shRNA2为最佳干扰片段，即pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm，用于后续试验；(5)pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm对小鼠组织中CTRP6表达的影响：将试验小鼠随机分为4组，I组：Chow，pLentiH1‑scramble处理组；II组Chow，pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm处理组；III组HFD，pLentiH1‑scramble处理组；IV组HFD，pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm处理组；I组、II组正常饲喂，为正常日粮组，III组、IV组高脂饲喂诱导肥胖，为高脂日粮组，饲喂10周后开始注射pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm慢病毒，并且每隔3d注射一次，连续注射5周后，利用RealtimePCR技术检测肝脏组织、附睾脂肪组织、腹股沟脂肪组织、棕色脂肪组织和肌肉组织中CTRP6mRNA的表达水平，发现pLentiH1‑CTRP6‑shRNAm慢病毒能显著降低CTRP6的表达，利用Western Blot的方法，发现在附睾脂肪组织、腹股沟脂肪组织、棕色脂肪组织中CTRP6的蛋白水平也明显下降。