[发明专利]离体氧糖剥夺模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种离体氧糖剥夺模型的建立方法，包括以下步骤：S1：首先设置雌雄小鼠进行配对，在雌雄小鼠交配成功后，再将雌雄小鼠进行分离；S2：在雌性小鼠怀孕13‑15天时，雌性小鼠在用多聚赖氨酸涂层培养板上进行过夜；S3：在用多聚赖氨酸涂层培养板上11‑13h后，移除多聚赖氨酸，然后雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板上；S4：雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板2‑4h后，移除层粘连蛋白后，用消毒蒸馏水对培养板进行冲洗。本发明能够精确，快速，有效地模拟细胞应激，细胞自噬及脑缺血缺氧休克等病理状态，且小鼠原代大脑皮层神经元细胞十分容易达到氧耗竭的目标。

主权项

离体氧糖剥夺模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：首先设置雌雄小鼠进行配对，在雌雄小鼠交配成功后，再将雌雄小鼠进行分离；S2：在雌性小鼠怀孕13‑15天时，雌性小鼠在用多聚赖氨酸涂层培养板上进行过夜；S3：在用多聚赖氨酸涂层培养板上11‑13h后，移除多聚赖氨酸，然后雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板上；S4：雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板2‑4h后，移除层粘连蛋白后，用消毒蒸馏水对培养板进行冲洗；S5：雌性小鼠在怀孕15‑17天时,从雌性小鼠中剖析出胚胎子宫，并将剖析出胚胎子宫置入盛有冰冻的L‑15液体的培养板中；S6：通过超镜台可以从胚胎子宫中取出胚胎，再通过超镜台从胚胎中移出脑，此时可以收集大脑皮层，并将收集的大脑皮层置入盛有冰冻的L‑15液体的培养板中；S7：使用刀片对冰冻的L‑15液体中的大脑皮层进行切段，将切段后的大脑皮层置入15ml的离心管中；S8：离心管中的切段大脑皮层在1400RPM‑1600RPM的条件下进行第一次离心，且离心2‑4m；S9：在第一次离心后的离心管中滴入用2‑4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，再将离心管的溶液置入37度孵箱混匀4‑5m，经蛋白酶消化后加入2‑4ml的抑制剂溶液终止反应；S10：离心管中的溶液在1400RPM‑1600RPM的条件下进行第二次离心，且离心2‑4m；S11：在第二次离心后的离心管中滴入用2‑4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，混匀细胞悬液，然后使用细胞过滤器对细胞悬液中的细胞进行过滤，并对细胞溶液中的细胞进行计数；S12：细胞计数后，将细胞移植到培养板上，细胞移植到培养板71‑73h后，加入4‑6uM的Ara‑C；S13：细胞在培养板上培养五‑七天时，对培养板中的40％‑60％的培养液进行更换；S14：小鼠原代大脑皮层神经元细胞在培养板上培养8‑10天时，可以对小鼠原代大脑皮层神经元细胞进行氧糖剥夺；S15：将进行实验的小鼠原代大脑皮层神经元细胞分为氧糖剥夺组和正常组；S16：对于氧糖剥夺组，使用真空抽干机吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体1‑2h，对于正常组，不需抽吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体，并向无葡萄糖Early’s盐溶液中加入葡萄糖；S17：用含葡萄糖的Early’s盐溶液替换正常组中的培养液，氧糖剥夺组在正常组使用含葡萄糖的Early’s盐溶液作为培养液的50‑70m后，氧糖剥夺组中的小鼠原代大脑皮层神经元细胞置入厌氧模块化培养室4‑6m，然后继续放入培养箱中孵育4‑12h。